分子生物实验技术原理,污染控制与资源化研究国家重点实验室 20120319,一、DNA提取原理和方法,核酸的理化性质 ：DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,DNA提取原理,天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。,步骤,1、细胞破碎 三种方法 机械方法：超声破碎法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：SDS处理； 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，使细胞壁破碎。,DNA提取的几种方法,(1) 浓盐法： A. 利用RNA和DNA在电解液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化钠溶液抽提,得到的DNP粘液与氯仿：异戊醇（24:1）一起振荡，使乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。 B. 用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。 A/B两种方法比较, B法使核酸降解可能少一些。,C. 以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制样品中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用1.5M NaCl，0.015M柠檬酸钠（并称SSC溶液）提取DNA。,（2）阴离子去污剂法,用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA，由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。,（3）苯酚抽提法,苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的活性。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 。,（4）水抽提法,利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇。立即用搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以洗涤，最后在空气中干燥，即得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。,环境样品常见的有水样、土壤、生物膜等 水样可以先用0.22um的微孔滤膜过滤，然后把微孔滤膜剪碎，用于提取DNA 土壤、垃圾、生物膜、活性污泥这些样品因为杂质较多，在提取时要考虑杂质的影响，可先预处理去除一部分干扰物质后再提取 具体方法很多：直接提取法、间接提取法,1、水样DNA提取,用0.22um微孔滤膜过滤水样，将滤膜放入离心管，加TE 充分震荡混匀，12000rpm收集菌体，再悬浮于1ml TE，加20ul 20mg/ml 溶菌酶，室温10min；加40ul蛋白酶K，37度1h，加1/3体积5M NaCl，剧烈震荡混匀， 12000rpm 离心5min，上清液用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，上清液加0.6V异丙醇沉淀离心后70%乙醇洗涤沉淀，再溶于TE中，加1/10V 3M pH5.2 NaAc后，2.5V 无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤后溶于50ul TE中，测定A260/A280， A260/A230 确定DNA的纯度和浓度 A260/A280 : 是衡量蛋白质污染程度的指标，通常在1.7-1.8之间较好； A260/A230：衡量腐殖酸污染程度的指标，一般在1.7-2.0 之间较好。,常用试剂盒品牌,MP Bio公司Fast-Prep SPIN Kit（for soil） Mo Bio公司ultra clean soil DNA kit power clean soil DNA kit Qiagen公司：QIAamp DNA Stool Mini Kit Omiga 公司 国产试剂盒 按试剂盒操作说明提取样品DNA，置-20保存备用,Fast-Prep SPIN Kit（for soil） 操作说明,1、称量500mg土样（离心适量活性污泥）到一个Lysing Matrix E管中，冰上静置2min。 2、加978ul的sodium phosphate buffer 到样品管中 3、加122ulMT buffer (保持管中有250500ul剩余空间） 4、在振荡器中充分振荡混匀 5、13000rpm离心10min 6、将上清液转入到一个新的无菌2ml离心管中，加250ul PPS(蛋白质沉淀剂），手动混合10次 7、13000rpm离心5min，将上清液转入到一个无菌15ml离心管中（可用10ml管代替） 8、摇匀Binding Matrix suspension，加1ml到15ml管的上清液中,9、振荡离心管2min使DNA充分结合，再静置3min来沉淀Si化合物 10、小心的弃去700ul的上清液 11、重新悬浮剩余的上清液中的混合液，吸取700ul混合液到SpinTM Filter中，13000rpm离心1min，倒空收集管，再将剩余的混合物加入到SpinTM Filter中，如前操作 12、加入500ulSEWS-M,轻柔的悬浮管中的Si 化合物 13、13000rpm离心1min，倒空收集管（重复12、13步一次） 14、13000rpm离心2min，使收集柱干燥，并将其置于一个新的无菌离心管中 15、在室温下静置5min，空气干燥SpinTM Filter 16、小心的加入50100ul的DES（或ddH2O),使所有的Si化合物湿润，55温浴5min 17、13000rpm离心1min，弃去SpinTM Filter，液体保存备用,电泳检测,二、PCR扩增,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR ）：是一项在体外、短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。,Kary B. Mullis,PCR技术的创建,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,94变性,50-65退火,XX延伸,72,94,55,PCR循环,1、PCR技术的原理,PCR的原理：以单链DNA为模板、4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。,PCR的三个基本步骤,(1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解 链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(5060)下与模板上的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension): DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR原理 变性(denaturatation) 退火( annealing) 延伸(extension),2、PCR反应五要素,引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP, dGTP, dCTP, dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各50200umol/L 引物 10100pmol/L 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 0.5 2.5U Mg2+ 1.5mmol/L 加灭菌的双或三蒸水至 100ul,1）引物,引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 每条引物浓度一般 10100pmol/L, 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,2）酶及其浓度,目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 典型的 PCR反应约需酶量 0.5-2.5 U/50l 酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,3）dNTP 的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP溶液呈酸性， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解，保存不当易变性失活。 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度取决于扩增片段的长度，注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔） 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低,单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,4）模板,5） Mg2+浓度,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。 适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,3、PCR反应条件的选择,PCR反应条件: 温度 时间 循环次数,1）温度与时间的设置：,设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸, 变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般9394lmin足以使模板DNA变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败, 退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高