PCR基因扩增,一、实验目的,通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术,二、实验原理,PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法，由美国人B.Mullis于1983年发明 包括三个基本步骤: 变性（Denature）：目的双链DNA片段在94下解链 退火（Anneal）：两种寡核苷酸引物在适当温度（50 左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经2535轮循环就可使DNA扩增达106 倍,1、PCR反应中的主要成份,引物 dNTP Mg2+ 模板 Taq DNA聚合酶 反应缓冲液,引物,PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定 引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则： 引物长度约为1630bp 引物中G+C含量通常为40%60%，可按Tm4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度 四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发 引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对 在引物内，尤其在3端应不存在二级结构 两引物之间尤其在3端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量 引物5端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点 引物不与模板结合位点以外的序列互补 简并引物应选用简并程度低的密码子 引物的浓度一般为0.10.5mol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量,dNTP,dNTP常用的浓度为20200mol/，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足而出现的错误掺入 dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度 注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系,Mg2+,Mg2+浓度会影响Taq DNA聚合酶的活性、真实性，影响引物退火、解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等 通常Mg2+浓度范围为0.52mmol/L 在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度,模板,PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，单链分子、双链分子、线状分子或环状分子均可以作为模板 DNA （线状分子比环状分子的扩增效果稍好） 模板的数量和纯度均会影响PCR结果：一般反应中的模板数量为102 105 个拷贝。模板拷贝数过多可能会增加非特异性产物 模板DNA中的杂质也会影响PCR的效率,Taq DNA聚合酶,早期PCR扩增是由大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段完成，但这种酶不耐热，所以每一轮循环在变性和退火后必须加入新酶 后来引入耐热的Taq DNA聚合酶，一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min，95 40min，97 5min，因此PCR中变性温度不宜超过95 Taq DNA聚合酶的最适温度是72 ，连续保温30min仍具有相当的活性，一次加酶可满足PCR反应全过程的需要 纯化的Taq DNA聚合酶有53外切酶活性，而无35外切酶活性，不具有Klenow酶的35校对活性，因此在PCR中有错误掺入率，大约是每2104个核苷酸中有一个，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤为注意 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74下，30min掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。在100L反应体系中，1.52U的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环 使用Taq DNA聚合酶浓度过高，可引起非特异性产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少,反应缓冲液,一般含100mmol/L TrisCl （20下pH8.3-8.8）, 500mmol/L KCl和0. 1的明胶，有时候还有适当浓度的Mg2+ TrisCl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性 KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性 明胶保护酶不变性失活 Mg2+影响Taq DNA聚合酶的活性，直接影响反应的特异性和扩增DNA的产率 反应液可加入5 mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100g/ml的牛血清白蛋白（BSA），它们可稳定酶活性,2、PCR反应参数,变性 退火 延伸 循环次数,变性,变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的 DNA双链会很快复性，减少DNA产量 一般变性温度与时间为94 1 min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。 对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失,退火,引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度 实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。一般当引物中GC含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高 有些反应可将退火与延伸两步合并，只用两种温度（如用60和94）完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性 退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为3755，1-2min,延伸,延伸反应温度通常为72，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75 Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从2085，引物延伸在退火时即已开始 延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。一般反应 体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间 扩增反应完成后，都需要一步较长时间（1030min）的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要,循环次数,当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度 一般而言2530轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加 通常2530轮循环扩增后，反应中Taq DNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达1091010,PCR Cycle 1,Primers,Taq,Taq,Double stranded DNA template,Following n cycles of PCR there will be No(1+Y)n copies No initial number of targets Y efficiency of PCR reaction n cycle number,三、仪器、材料与试剂,PCR热循环仪 移液枪（配套枪头） DNA模板（质粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因） 2.5mmol/L dNTP（TaKaRa） 10PCR缓冲液（TaKaRa） 25mmol/L MgCl2 （TaKaRa） 引物1、引物2（5pmol/L） 引物1：5-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3 引物2：5-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3 Taq DNA聚合酶（TaKaRa）,四、实验步骤,PCR反应体系的配制，即在0.5mL Eppendorf管内配制25L反应体系，按下表准确加入各反应物,PCR反应条件的设置，即在PCR热循环仪上设置程序，按程序设置的条件进行扩增 94 预变性5min 94 变性40sec 55 退火50sec 72 延伸50sec 72 延伸8min 12 for ever 1琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果（此步骤与下次实验PCR扩增产物的割胶纯化一起进行）,重复30次,五、思考题,PCR反应的基本原理是什么？ 典型的PCR反应体系由哪些组分组成？ 绘出电泳结果图，若实验结果可见拖尾现象或有几条区带，试分析是什么原因造成的？该怎样解决？,？,