第三章 细胞生物学研究方法,Chapter 3 Techniques in Cell Biology,第一节 显微技术,细胞生物学的建立和发展得益于光学显微镜的发明； 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能的研究达到了新的水平。,光学显微镜与电子显微镜的主要差别在所使用的光源不同，但分辨率却相差非常大： 光学显微镜的最大分辨率：0.2m 电子显微镜的分辨率：0.2nm,一、显微镜的成像原理,所有类型的显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素： 1、照明系统； 2、被观察的物品； 3、聚焦成像的透镜系统,照明系统的波长是显微镜成像的重要因素，因为波长能决定被检测物体的最小极限，波长越长，波幅的跨度就越大，所能观察到物体的极限就越大。,1、分辨率（Resolution）,是指能分辨出相邻两个物点间的最小距离的能力。 一般规定：显微镜或人眼在25cm明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，称分辨率。,分辨力可用公式计算： R=0.61 /N.A. N.A.sin 式中： =波长；n=介质折射率；=镜口角（标本对物镜镜口张角的1/2），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于90，sin 的最大值小于1。,不同光源的波长,2、最大分辨率,R值越小，分辨率越高，即需要尽可能地小，和N.A.尽可能大。 可见光中以蓝光波长最短， =450nm； 目前最好的玻璃透镜的=70 ， sin =0.94; 空气的折射率n1； 所以光镜的最大分辨率： R=450/1*0.94=292nm=0.3m,3、分辨极限与放大率,显微镜的最大分辨率即是它的分辨极限。 最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率（magnification）。 总放大率=物镜的放大率*目镜放大率 放大率受分辨极限的限制。一般，光学显微镜的最大放大率只能是数值孔镜（N.A.）的1000倍。,二、光学显微镜,（一）、普通双目显微镜 *照明系统：可见光源 *光学放大系统：由物镜和目镜组成，都是由玻璃透镜组构成；在物镜上方装有4个棱镜，使物镜的光线平分为两路到达目镜 *机械和支架系统：保证光学系统的准确配制和灵活调控,1. The Light Microscopy（LM）,光镜观察样本的制备,取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察,石蜡切片.,2、倒置显微镜,组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，普通显微镜在载物台之下，倒置显微镜在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。,3、暗视野显微镜 （dark field microscope）,聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 能观察 4200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。,4、荧光显微镜,是对能发荧光的物质进行定性和定量研究的工具。 细胞中有些物质如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光； 有些物质本身虽不能发荧光，但用荧光染料染色，紫外线照射也发荧光。,荧光显微镜和普通显微镜区别：,1、照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2、光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3、有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。,5、激光共聚焦扫描显微境 （laser confocal scanning microscope）,*用激光作光源，逐点、逐行、逐面扫描成像，激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 *调焦一次，扫描限制在样品一个平面。调焦深度不一时，可获样品不同层次图像，经计算机模拟，能显示样品的立体结构。 *激光波长短，光束细，分辨率是光镜的3倍。,Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.,6、相差显微镜 （phase-contrast microscope）,由Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。 最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。,基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差（明暗差），从而提高了各种结构间的对比度，使结构变得清晰可见。 光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4，如再增加或减少1/4，则光程差变为1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。,构造上，相差显微镜不同于光镜之处： 1、环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2、相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased.,7、微分干涉显微镜 （differential-interference microscope）,1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明。 优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，标本可略厚，折射率差别更大，故影像立体感更强。,图2-10 DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）,DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。,四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： (A) 明视野显微镜； (B) 相差显微镜； (C) 微分干涉显微镜； (D) 暗视野显微镜,二、电子显微镜,光学显微镜受照射光波长的限制，在可见光下其分辨极限只有0.2m，即使在紫外光下，最大分辨率也只有0.1 m，要观察更精细的结构，只有借助分辨率更高的电子显微镜。,（一）透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM),Ruska 1932年发明。 以电子束为光源，波长比可见光和紫外光短得多，且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比。 最大分辨率达0.2nm。,1、透射电镜的结构,由5部分组成： 1、电子照明系统：电子枪； 2、真空系统：用真空泵和油扩散泵获得高真空； 3、电磁透镜成像系统：规范电子的行为； 4、记录系统：用荧光屏观察影像，用照相系统记录影象； 5、电源系统：提供高压稳压。,2、电镜制样技术,（1）超微切片技术,石蜡切片: 3-10um; 超薄切片: 40-50nm,Sections of LM: 5um; Sections of TEM: 100nm,由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。,Thin sections,copper grid used to support the thin sections of a specimen in the transmission electron microscope.,Specimen Preparation for Electron Microscopy,Two common chemical fixatives used for electron microscopy. The two reactive aldehyde groups of glutaraldehyde enable it to cross-link various types of molecules, forming covalent bonds between them. Osmium tetroxide is reduced by many organic compounds with which it forms cross-linked complexes. It is especially useful for fixing cell membranes, since it reacts with the C=C double bonds present in many fatty acids.,Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen.,通过连续切片达到被检样品的三维结构的重构,（2）负染色技术,负染是用重金属盐（磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色； 吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，呈负染效果，分辨力可达1.5nm。,经负染的肌动蛋白纤维,(3)冰冻蚀刻(freeze-etching),样本置-196C液氮中冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，冰在真空下迅速升华，暴露出断面结构，称蚀刻。 蚀刻后，向断面喷涂一层铂和碳，加强反差和强度。再用次氯酸钠溶液消化样品，剥下碳和铂的膜，即复膜。复膜代表标本蚀刻面的形态，电镜下的影像即代表标本断面的结构。,（二）扫描电镜 （Scanning electron microscope (SEM),*问世于20世纪60年代； *用来观察标本的表面结构。 *扫描电镜的分辨力为610nm，最大有效放大倍率为20000X。,工作原理,*用细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品的表面结构有关。 *次级电子由探测器收集，转为光信号，再经光电倍增管和放大器转为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示扫描图像。图像为立体，显示标本表面结构。,为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,培养中的小鼠成纤维细胞扫描照片,三、扫描隧道显微镜 (scanning tunneling