基因工程原理,Principle of Gene Engineering 杨红,第四章,第四章 目的基因的分离与修饰,第一节基因的基本结构特征 第二节 基因组文库 第三节 目的基因的分离与制备 第四节 基因突变与修饰,一个能转录、翻译的结构基因依次包括：,转录启动区 核糖体识别区 编码区 转录终止区,起始密码子ATG 开放阅读框 终止密码子（TAG、TAA、TGA）,第一节 基因的基本结构特征,一、原核生物基因的组成,基因区 启动区 SD区 转录终止子和终止因子,原核生物基因启动区的结构,乳糖操纵子模型,二、真核生物基因的组成,基因区 转录启动区 转录区,三、其它基因组的基因组成,编码区 启动子 终止子,质粒基因,病毒（噬菌体）基因：多顺反子、重叠基因、内含子,线粒体基因：多顺反子,叶绿体基因：多顺反子,四、基因的排列,重叠基因：是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。,重复基因：重复基因指染色体上存在多数拷贝基因，重复基因往往是生命活动最基本，最重要的功能相关的基因。,加倍基因,基因重排：基因的可变区通过基因的转座、DNA的断裂错接而使正常基因顺序发生改变的现象。尤指在B细胞分化过程中抗体基因的重排及T细胞抗原受体基因的重排，是基因差别表达的一种调控方式。,第二节 基因组文库,基因组文库（DNA文库）：某种生物的基因组DNA通过克隆载体储存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的DNA文库。 cDNA文库：某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这个群体叫cDNA文库。,基因文库（gene library) 某种生物的全部遗传信息通过克隆载体储存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因文库。,1. 基因组文库的大小 是指文库中的克隆子数量。,例如：某生物基因组的总长3106kb，酶切后DNA平均长15kb，则其基因组文库的克隆子数为： 3106kb/ 15kb=2 105个,一、原核生物基因组文库的构建,1976年，Clark等提出估算克隆子数的公式。 N=ln（1-P）/ ln（1-f） N：基因组文库必需的克隆数目 P：文库中目的基因出现的概率（99%） f：插入片段大小于基因组大小的比值 例如上面例子： N=ln（1-0.99）/ ln（1-15/ 3106）= 9105个,为了保证基因组文库具有代表性，一般构建基因组文库的实际克隆子数应该比上述计算值大23倍,与基因组大小成正比 与克隆的DNA片段大小成反比 与载体的容量有关： 某一生物如果用质粒作载体需要900万个克隆， 用噬菌体需要90万个克隆， 用cosmid作载体需要35万个克隆。,2. 用于构建DNA文库的克隆载体,EMBL系列、 DASH、 2001等 优点： 载体双臂DNA序列已经确定 有易于筛选的遗传标记 EMBL和2001有Spi-标记 易于从重组噬菌体中回收插入的外源片段。,（1）制备基因组DNA并片段化,3. 构建基因组文库的基本步骤,提取总基因组DNA 切割：机械方法、 RE法、识别序列4位点 回收：电泳、梯度离心,（2）DNA片段与载体重组连接,+,4. 原核生物基因组文库的构建,二、真核生物基因组文库的构建,1. 构建噬菌体基因组文库,2. 用Cosmid构建基因组文库,3. 构建酵母人工染色体基因组文库,三、 cDNA基因文库的构建,从基因组分离基因难度大： 基因以单拷贝形式存在，占染色体DNA的10-510 7； 真核染色体DNA大，难定位基因； 真核生物基因有内含子，在原核细胞表达时没有加工功能。,1. cDNA文库的概念,某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这个群体叫cDNA文库。,表达型cDNA文库：直接检测表达产物-蛋白质，筛选重组克隆，不知道目的基因序列和蛋白氨基酸序列。 非表达型cDNA文库：已知目的基因序列或蛋白氨基酸序列，可以通过杂交筛选。,2. cDNA文库的构建,（1）分离细胞总RNA，并从总RNA中分离纯化出mRNA,总RNA包括：,rRNA（80-85%） tRNA（10-15%） mRNA（1-5%,总RNA的提取： 与DNA的提取相似。 沉淀细胞裂解细胞离心去残渣上清液除蛋白沉淀RNA。,mRNA的纯化 Poly（A）RNA的分离 柱层析Oligo（dT）,mRNA分级： 梯度离心，电泳， mRNA转译活性鉴定 无细胞体系（兔网织红细胞裂解物） 蛙卵系统（非洲爪蟾卵母细胞系统）,Oligo（dT）引导的cDNA合成,mRNA-cDNA,（2）以mRNA分子为模版，合成cDNA第一链,（3） 双链cDNA的合成, 大肠杆菌RNaseH媒介取代法, Oligo（dG）寡聚引物引导法合成双链DNA, PCR法,（4） 将合成的双链cDNA重组到质粒或噬菌体载体上，导入大肠杆菌增殖, 以质粒为载体构建cDNA文库： 重组子鉴定、文库扩增方便。克隆效率低。,末端转移酶,dGTP, 以噬菌体为载体构建cDNA文库 克隆效率高，重组子鉴定、文库扩增繁琐。, mRNA丰度与cDNA文库大小的关系,cDNA文库大小的理论估算：,例如：细胞总mRNA数为500500个， 丰度为3500拷贝/细胞的基因，其cDNA文库应为：500500/3500=143个克隆； 丰度为14拷贝/细胞的基因，其cDNA文库应为：500500/14=35750个克隆；,N：cDNA基因组文库必需的克隆数目 P：文库中目的基因出现的概率（99%） f：mRNA丰度与总mRNA比值,实际cDNA基因文库大小： N=ln（1-P）/ ln（1-f）,例如，丰度3500时，N是650个。 N=ln（1-0.99）/ ln（1-3500/ 500500）= 650个,4. cDNA克隆的优越性,cDNA克隆适合RNA病毒的研究 cDNA文库的筛选比较简单易行 目的基因筛选的假阳性率低 可以克隆在细菌中表达的基因 用于mRNA的结构和功能的研究,第三节 目的基因的分离与制备,基因文库分离法 PCR扩增法 差式分析法 DNA插入诱变法 基因定位克隆 标签测序法 化学合成法,一、从基因文库中筛选分离目的基因,1. 制备核酸探针进行杂交筛选,制备猜测体探针： 根据已知氨基酸顺序人工合成探针。 探针的特异性：长度不小于17-20bp（6个以上连续氨基酸顺序） 遗传密码的简并性：一组探针，导致假阳性。,将已知蛋白作为抗原，从cDNA表达文库中筛选。 cDNA应克隆在表达载体中 一般以融合形式表达目的基因 考虑cDNA表达的方向性 Western blotting方法,2. 制备抗体进行免疫杂交筛选,disulfide bridges,抗原-抗体免疫反应,必须在特异性蛋白纯化后应用 某些基因的表达量很少，难以纯化 有些基因没有蛋白产物 不同发育阶段、不同环境下蛋白不同 遗传密码简并性导致正确探针的难度。,利用被克隆DNA片段与寄主细胞染色体DNA在功能上的同源互补性筛选目的基因。 例如：大肠杆菌His缺陷型寄主细胞，原因之一是吲哆甘油磷酸脱氢酶基因突变。利用这特点，筛选面包酵母吲哆甘油磷酸脱氢酶基因。,3. 功能互补法克隆基因,4. 利用PCR技术筛选基因文库,5. 利用噬菌体表面显示技术分离目的cDNA克隆,噬菌体表面显示技术：也称噬菌体展示技术，将外源蛋白质或多肽的基因插入到丝状噬菌体外壳蛋白质基因的信号肽后，与噬菌体外壳蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面，借助于固体基质上附着的抗体、受体等分子与靶分子的亲和力，筛选目的蛋白。,是研究蛋白质相互作用的一种重要方法。,. 利用酵母双杂合系统分离目的cDNA克隆,酵母双杂交技术原理,利用转录激活因子GAL4的特性而建立的。,GAL4,GAL4由两个结构域组成：,N端的DNA结合域(DB) C端的转录激活域(AD),酵母双杂交技术研究蛋白质之间的相互作用是细胞内实验，即不需提纯蛋白便可研究蛋白的相互作用，消除了提纯过程引起的蛋白变性，因而研究的是有生物活性的蛋白与蛋白之间的相互作用，反映了体内的真实作用情况。,大规模酵母双杂交技术的局限性 酵母双杂交筛系统虽因其优点而广泛用于研究蛋白质相互作用，但也有其自身固有的缺点，如实验设计、结果处理和分析时都要考虑的假阳性和假阴性问题。,假阴性产生的原因 细胞定位特性出现假阴性结果：分泌蛋白难以检测； 蛋白未能正确修饰和折叠； 有的蛋白对酵母菌株有毒性或抑制菌株生长, BD-X的自激活作用； 一些AD-Y融合蛋白中的Y可能结合BD或启动子附近序列或蛋白，并能激活转录； BD-X与AD-Y并非通过BD-XY-AD直接激活转录，而是通过第3种蛋白或多蛋白的复合体把X、Y募集到一起，然后激活转录； 非特异BD-XY-AD相互作用，因为有的蛋白表面具有成簇的疏水氨基酸或其它可引起X、Y非特异作用的结构；,假阳性产生的原因,二、利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因,PCR技术的基本原理：,1. 套式PCR技术(nested PCR),巢式PCR（nested PCR），是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。,2. 反向PCR技术(inverse PCR),未知序列,已知序列,3. 锚定PCR (anchored PCR),RACE: rapid amplification of cDNA,是以mRNA为模板,逆转录合成cDNA的第一条链,然后用PCR技术扩增出从某个特定为点到3和5端之间的未知核苷酸序列,对应成为3RACE和5RACE.,Oligo(dT)n,锚定引物,4. 不对称PCR (asymmetric PCR) 5. 长程PCR(long and accurated PCR, LA PCR) 6. 逆转录PCR(RT-PCR) 7. Alu PCR,三、利用差式分析法分离目的基因克隆,1. mRNA 差别显示技术（DD-PCR）,mRNA 差别显示技术的原理和基本程序,. 代表性差别分析技术,（） 传统的减法杂交技术,从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录成cDNA，与无目的基因表达的组织中提取的mRNA杂交形成cDNA-mRNA双链分子，通过层析去掉杂交分子后，留下的单链cDNA中含有目的基因。,逆转录,无目的基因表达的组织中提取的mRNA,表达目的基因组织中提取的mRNA,（） 基因组DNA的代表性差别分析技术,（） cDNA RDA, 抑制性减法杂交技术（SSH）,四、 DNA插入诱变分离目的基因,1. 转座子标签法,. T-DNA标签法,五、 应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因,1. 基因定位克隆的基本步骤,. 染色体步查法分离目的基因（chromosome walking）,六、 标签测序法分离目的基因,1. 表达序列标签法（EST）,是指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其它基因的差异，长度为100-500bp。,. 基因表达序列分析法（SAGE）：（1）从转录物某一特定位置上分离得到一段9-10kb的寡核苷酸引物，该引物含有确定一个独特转录物的足够信息，可以代表此转录物的特异性；（2）多个序列标签能以锚定酶识别为点序列相隔连成双标签序列的多联体。,生物素-oligo(dT),七、基因的酶法合成,第四节基因的突变与修饰,一、随机诱变,1. 盒式诱变（cassette mutagenesis）,2. 化学诱变,. 易错PCR诱变（error-prone P