第四章 基因工程的操作过程,一、DNA的体外重组（切、接） 二、重组DNA分子的转化和扩增（转、增） 三、转化子的筛选和鉴定（检）,一、DNA的体外重组（切与接）,1、相同粘性末端的连接 2、平末端的连接 3、不同粘性末端的连接 4、人工粘性末端的连接 5、酶切位点的定点更换 6、重组率,同种限制酶产生的粘端的连接 同尾酶产生的粘端的连接,1、相同粘性末端的连接：,同种限制酶产生的粘端的连接,5,5,AATTC,G,同尾酶产生的粘端的连接,2、平末端的连接：,提高平端连接效率的方法：,加大连接酶用量（10倍于粘端连接, 1-2U）；,加大平端DNA片段的浓度；,加入10% PEG 8000；,加入单价阳离子(NaCl)，终浓度150-200 mM。,16连接过夜（粘端连接16 4hr或4过夜）；,3、不同粘性末端的连接：,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,G,CTTAA 5,5,5 AATTC,G,BamH I,EcoR I,目的基因,1）两种DNA分子都有5突出末端：,2）两种DNA分子都有3突出末端：,3）一种DNA分子有5突出末端，另一种有3突出末端：,4）两种DNA分子都有2个不同的粘性末端：,4、人工粘性末端的连接：,5突出末端,3突出末端,平末端,1）平末端人工粘性末端的连接,2） 5突出末端人工粘性末端的连接,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,G,CTTAA 5,5,5 AATTC,G,目的基因,3） 3突出末端人工粘性末端的连接,5、酶切位点的定向更换,6、重 组 率,在常规实验条件下，重组率一般为25-75%。,提高重组率的方法：,加装同聚尾。,提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1；,载体DNA分子在连接前去除5-P；,载体DNA分子在连接前先去除5-P：,5,G,CTTAA,5 AATTC,G,目的基因,加装同聚尾：,二、重组DNA分子的转化和扩增（转与增）,转化技术及其原理 转化率 转化细胞的扩增,转化：,将DNA重组分子导入特定的受体细胞，使之无性繁殖，高效表达外源基因，或直接改变其遗传性状，这一过程及操作称为DNA重组分子的转化(transformation)。,Ca2+诱导转化法 原生质体转化法 噬菌体DNA的转染 电穿孔转化法 三亲本杂交转化法,1、重组DNA分子导入原核细胞,1）Ca2+诱导转化法：,Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态称为感受态。,适用于革兰氏阴性菌（如E.coli）。,感受态细胞的制备,感受态细胞的转化,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌；,必须在冰冷的条件下制备；,CaCl2悬浮菌体要充分；,储存感受态菌要在-70以下；,使用感受态菌时，必须在手里或水浴迅速融化，融化后不能再次冻存使用。,注意事项：,2）原生质体转化法：,革兰氏阳性菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，常采用原生质体（细胞去壁后形态）转化法。,也适用于酵母、真菌、植物细胞。,细菌原生质体转化流程,细菌原生质体的制备 细菌生长于高渗培养基（如34%蔗糖溶液）中， 加入甘氨酸以增加细胞壁对溶菌酶的敏感性。 制备过程中，菌体始终悬浮在10.3%蔗糖等渗溶液。,3）噬菌体DNA的转染：,必须先在体外将重组-DNA包装成有感染力的重组噬菌体颗粒。,用于体外包装的蛋白已商品化，通常为互补两部分：一部分缺少E组份，另一部分缺少D组份。当这两部分同时与重组-DNA混合时，包装才能有效进行。,噬菌体DNA转染流程,感受态细胞的培养 将E.coli培养至OD600=0.5。,4）电穿孔转化法(electroporation)：,几乎对所有含细胞壁结构的细胞有效。,将重组DNA加入电穿孔转化仪的样品池，两极施加瞬时高压电场。在强大电场作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，重组DNA分子进入细胞。,电穿孔转化的流程,5）三亲本杂交法(triparental mating)：,被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌、含广泛宿主辅助质粒的辅助菌共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体菌细胞内。,当重组DNA分子不能直接转化受体菌时，可采用三亲本杂交转化法。,2、重组DNA分子导入植物细胞,根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法 植物病毒介导的转染 电穿孔转化法 基因枪转化法 激光微束穿孔法 多聚物介导法 花粉管通道法,根癌农杆菌(A.tumefaciens)是普遍存在土壤中的革兰氏阴性菌，能在自然条件下特异性感染几乎所有双子叶植物（尤其豆科类植物）的根部和受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。,1）根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法,根癌农杆菌的致瘤特性是由其细胞内的野生型Ti(Tumor-inducing)质粒介导的。,根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA插入植物基因组中，随其复制而复制。,用携带外源基因的Ti质粒转化植物原生质体，外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株-转基因植物。,病毒载体能将外源基因导入植物所有组织和细胞中，且不受单子叶或双子叶的限制。,如：以花椰菜花斑病毒(CaMV)基因组为载体，去除致病基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，由此再生成完整植株。,2）植物病毒介导的转染,3）电穿孔转化法：,将重组DNA加入植物细胞原生质体中，在200-600V/cm电场中处理若干秒，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2w，再生出完整植株。,4）基因枪转化法：,又称微弹轰击法，1987年由美国康奈尔大学的Sanford发明。,将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，整合到植物基因组中并得以表达。,基因枪工作原理,真空加速管,压缩氨气,吸附微粒的膜,包裹DNA的金属颗粒,目标细胞,枪的威力430 m/s,5）激光微束穿孔法：,利用直径小、能量高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下用激光处理细胞，处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。,最适于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。,6）多聚物介导法,聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，以PEG应用最广。,这些多聚物同二价阳离子和DNA混合，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，促使DNA进入细胞内。,7）花粉管通道法,授粉后向子房注射外源DNA，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，整合到基因组中，随受精卵发育而成为转基因植物。,1983年，由我国中科院周光宇提出。,我国推广面积最大的抗虫棉即是花粉管通道法培育出来的，占黄河、长江流域棉区种植面积的78.6%，占全国种植面积的60%以上。,3、重组DNA分子导入哺乳动物细胞,DEAE-葡聚糖转染法 磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 病毒颗粒转染法 显微注射法 电穿孔法,1）DEAE-葡聚糖转染法：,DEAE-dextran（二乙胺乙基葡聚糖）是一种高分子多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA。,2）磷酸钙转染法：,哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀，使DNA进入细胞。,将DNA和CaCl2溶液混合，然后缓慢滴入磷酸盐缓冲液PBS中，形成DNA-磷酸钙沉淀，粘附到细胞膜并通过胞饮进入细胞。,3）脂质体介导法：,脂质体是人工构建的、由磷脂双分子层组成的膜状结构，将外源DNA包裹其中，通过脂质体与细胞膜接触，可将外源DNA导入受体细胞。,转染率比裸DNA高100倍。如用PEG预处理受体细胞，可提高转染率10-20倍。,4）显微注射法(microinjection),鉴于哺乳动物细胞便于注射的特性，常利用显微注射法，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。,显微注射法的流程,5）病毒颗粒转染法：,病毒基因组为缺陷型，需辅助病毒一起感染受体细胞；,病毒直接感染受体细胞，目的基因随病毒DNA整合到其染色体DNA上；,病毒基因组为缺陷型，但受体细胞基因组中整合了病毒缺失的基因，无需辅助病毒。,腺病毒（adenovirus） 腺相关病毒（adeno-associated virus） 逆转录病毒（retrovirus） 慢病毒（lentivirus） 杆状病毒（baculovirus） 痘病毒（poxvirus）,常用的病毒载体：,4、转化率,在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受1个载体分子，因此转化率的定义也可表征为：1g载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数。,转化率是衡量转化效率的重要指标。 转化率=1g载体DNA进入受体细胞的分子数。,按转化1g pUC18需21010个感受态细胞，则每 个细胞中有1个细胞接纳pUC18 DNA。,3400,如：pUC18对E.coli细胞的转化率为108，则1g pUC18中有108个分子进入受体细胞。,按1g含3.41011个分子，则每 个pUC18分子中有1个分子进入受体细胞。,200,影响转化率的因素：,载体及DNA重组子方面 受体细胞方面 转化方法方面,1、载体及DNA重组子方面：,1）载体本身的性质：,不同载体转化同一受体细胞，转化率不同。,2）载体的空间构象：,经切、接操作后的载体DNA，因空间构象难以恢复，转化率比超螺旋结构的质粒低2个数量级。,质粒的超螺旋构象转化率最高；,3）插入片段的大小：,重组质粒分子量越大，转化效率越低。大于20kb的重组质粒很难进行转化。,2、受体细胞方面：,如：pBR322转化大肠杆菌JM83，转化率很低（103/g DNA）；但对ED8767株的转化率则较高（106/g DNA）。,受体细胞必须与载体匹配。,3、转化方法方面：,1）受体细胞的预处理：,对Ca2+转化而言，菌龄、Ca2+处理时间、感受态细胞的保存期、热脉冲时间等均为影响因素。感受态细胞在12-24h内转化率最高，分装后可在-70保存几个月。,感受态细胞的制备对转化率影响最大。,2）供受体的比例：,通常50-100ng的DNA对应于109个受体细胞或原生质体，加大DNA量并不能线性提高转化率，甚至使转化率下降。,DNA分子数与受体细胞数的比例对转化率也有影响。,3）转化方法：,不同转化方法的转化率不同。,5、转化细胞的扩增,指转化完成后细胞的短时间培养，往往与转化偶联在一起。,如：Ca2+诱导转化后的37培养1hr； 原生质体转化后的再生过程； -噬菌体转染后的30培养。,扩增的目的：,增殖转化细胞，以获得足量的细胞用于筛选；,扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选；,表达外源基因，便于筛选和鉴定。,三、转化子的筛选和鉴定（检）,根据载体遗传标记检测,外源基因产物检测,目的基因序列检测,重组率和转化率不可能达到100%的理想极限，必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。,非转化子：,转化子：,重组子：,非重组子：,非目的重组子：,目的重组子：,接纳载体或重组DNA的转化细胞；,未接纳载体或重组DNA的转化细胞。,含重组DNA的转化子；,仅含空载体的转化子。,含目的基因的重组子；,不含目的基因的重组子。,1、根据载体标记筛选：,1）抗药性筛选法：,可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。,Ampr、Tcr,Ampr、Tcs,基本操作：,2）营养缺陷型筛选法：,原理： 载体分子携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份。 在不含此营养组份的培养基上长出的便是转化子。,可区分转化子与非转