第五部分 POLD1基因表达受到抑制后对MCF-7细胞的生长及周期的影响,实验方法,Trizol提取MCF-7细胞总RNA 反义POLD1表达重组质粒pXJ41-as-POLD1的构建及鉴定 细胞转染及稳定表达细胞株的筛选 细胞生长曲线实验 血清依赖性实验 单细胞克隆形成实验 软琼脂集落形成实验 胸腺嘧啶核苷（TdR）双阻断法同步化MCF-7细胞 流式细胞光度术（FCM）进行细胞周期分析 Western blot鉴定转染细胞中特异性蛋白的表达,反义RNA,反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。 近年来通过人工合成反义RNA的基因, 并将其导入细胞内转录成反义RNA, 即能抑制某特定基因的表达,阻断该基因的功能, 有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。,结果与讨论,生长曲线的测定 血清依赖性实验结果 单细胞克隆形成率的比较 软琼脂集落形成比较 TdR 双阻断细胞后，流式细胞光度术（FCM）观察转染细胞周期的变化 Western blot检测转染细胞中周期相关基因的表达,引物设计,上游： 5 ATG TTT GGG TAC CAC GGG CAC 3,631 gctcccgaga gagcatgttt gggtaccacg ggcacggccc ctccccgttc ctgcgcatca,下游： 5 CCA GGA ATT CGA ATG TTT GTA 3,Kpn I,EcoR I,1261 ttccgtacct catctctcgg gcccagaccc tcaaggtaca aacattccct ttcctgggcc,pXJ41-as-POLD1重组质粒图谱,生长曲线的测定,转染细胞的血清依赖性实验,单细胞克隆形成率的比较,1: MCF -as-POLD1 2: MCF-7 3: MCF-pXJ41,软琼脂集落形成比较,1: MCF -as-POLD1 2: MCF-7 3: MCF-pXJ41,TdR 双阻断细胞后，流式细胞光度术（FCM）观察转染细胞周期的变化,Western blot检测转染细胞中周期相关基因的表达,1 2 3,A: CyclinE B: CDK2 C: CyclinD1 D: CDK4 E:Tublin 1: MCF -as-POLD1 2: MCF-7 3: MCF-pXJ41,A B C D E,