妩媚人生 http:/www.5may.net/,高效液相色谱的 使用与维护,浙江省疾病预防控制中心 蔡增轩,妩媚人生 http:/www.5may.net/,妩媚人生 http:/www.5may.net/,液相色谱仪器部件 日常维护 色谱图相关术语 实验操作与应用,妩媚人生 http:/www.5may.net/,妩媚人生 http:/www.5may.net/,一些商品化仪器,妩媚人生 http:/www.5may.net/,agilent,妩媚人生 http:/www.5may.net/,妩媚人生 http:/www.5may.net/,oe,妩媚人生 http:/www.5may.net/,妩媚人生 http:/www.5may.net/,HPLC的环境设置：,良好的接地 专门房间 定制台面 不间断电源 HPLC的日常操作条件： 温度：1030,最好是恒温； 空调器 相对湿度80,最好是恒湿; 除湿机 远离高电磁干扰、高振动设备; 有良好的通风设施; 通风罩,妩媚人生 http:/www.5may.net/,高效液相色谱仪组成,输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统,妩媚人生 http:/www.5may.net/,液相色谱流程图,妩媚人生 http:/www.5may.net/,HPLC,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,妩媚人生 http:/www.5may.net/,液相色谱的流动相,1. 流动相特性 （1）流动相（淋洗液，洗脱剂）：组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,2. 流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱,常用溶剂 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,3. 流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 正相液-液分配分离：先选中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),妩媚人生 http:/www.5may.net/,高效液相色谱流动相溶剂的物化性质（部分）,妩媚人生 http:/www.5may.net/,合适选择性溶剂,液相色谱溶剂选择范围,液相色谱流动相溶剂的选择步骤： 选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等 选择合适洗脱强度的溶剂：简单样品，2 k 5；复杂样品，0.5 k 20 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的值,所有溶剂,合适物理性质溶剂,合适保留值溶剂,妩媚人生 http:/www.5may.net/,液相色谱中的溶剂强度,1. 溶剂强度是描述色谱性能的主要指标，表示溶剂对样品的洗脱能力，它决定于溶剂与溶质之间分子的作用力。目前还没有一个统一标准描述不同类型液相色谱体系中的溶剂强度，而是采用相对极性和溶解度参数等作为溶剂强度指标。,1) 溶解度参数（参见溶剂选择性） 2) 极性参数P 根据固定相和流动相的极性大小, 人们把液相色谱分成： 正相色谱：固定相极性大于流动相 (包括硅胶吸附色谱) 反相色谱：固定相极性小于流动相,妩媚人生 http:/www.5may.net/,正相色谱：增加溶剂极性，保留时间增大或变小？,反相色谱：增加溶剂极性，保留时间又如何变化？,妩媚人生 http:/www.5may.net/,洗脱强度与溶剂极性,分子之间相互作用有色散力、偶极作用、氢键和介电作用。某一溶质与其它分子相互作用大小的程度可以用极性大小表示。极性越大, 它与其它分子的作用力越大。 “极性”溶剂容易吸收和溶解“极性”物质。,溶剂洗脱强度指流动相中溶剂的洗脱能力, 它不仅与流动相，而且与固定相的极性有关。在正相色谱中, “溶剂洗脱强度”与溶剂极性成正比；而在反相色谱中，溶剂极性越大, 洗脱能力越小。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,溶剂强度图,妩媚人生 http:/www.5may.net/,混合溶剂的极性,在液相色谱中, 一般溶剂的极性变化二个单位, 溶质的分配比差不多能有十倍的变化。通过溶剂强度参数的计算, 可以较好地较快地选择合适溶剂或调整流动相的极性范围。如： 正相色谱：k2 / k1 = exp (P1P2)/2 反相色谱：k2 / k1 = exp (P2P1)/2 在液相色谱常用混合溶剂作流动相。混合溶剂的P具有加和性： Pab = aPabPb , 为某一溶剂的体积分数。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,溶剂选择性分类,一般地说, 改变溶剂比例可调节流动相的极性, 从而使得组分的容量因子落在合适的范围内。但由于分子间相互作用的类型相同, 分离因子变化不大。因此专门研究了各种溶剂的选择性, 并将常用溶剂进行分类。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,妩媚人生 http:/www.5may.net/,质子给予体,偶极相互作用,质子接受体,溶剂选择性分类三角形图,Xe,Xd,Xn,1,2,3,4,5,6,7,8,纯质子接受体,强偶极中性化合物,纯质子给予体,妩媚人生 http:/www.5may.net/,1 组：脂肪醚（纯质子接受体） 2 组：脂肪醇（质子接受-给予体） 3 组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化） 4 组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体） 5 组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距） 6 组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈 7 组：芳烃、芳醚、硝基甲烷 8 组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体）,妩媚人生 http:/www.5may.net/,质子给予体,偶极相互作用,质子接受体,反相色谱中的溶剂选择性,1,甲醇2,TFH3,4,5,乙腈6,7,水8,妩媚人生 http:/www.5may.net/,质子给予体,偶极相互作用,质子接受体,正相色谱中的溶剂选择性,醚 1,2,3,4,二氯乙烷 5,乙腈 6,7,8,CHCl3 8,主溶剂：己烷,妩媚人生 http:/www.5may.net/,按溶剂分子的特殊作用类型分类, 采用三个不同的常数表示： Xe(接受质子参数)易与含羟基的分子作用(如酸类、酚类)； Xd(给质子参数)易与碱性化合物作用(如胺、亚砜等)； Xn(强偶极参数)易与偶极距较大的溶质分子作用(如硝基化合物、腈、亚砜和胺类等)。 通常把常用溶剂分成八组。同一组溶剂的三个选择性参数相近，其选择性相似。当某一溶剂不能提供足够的分离选择性时, 那么更换同组的其它溶剂亦不能提高选择性。改变溶剂时, 只有从距离较远的溶剂组挑选, 才可能使选择性有较大变化。因为当溶剂和样品分子的各种相互作用的相对重要性发生明显变化时, 流动相的选择性才会发生最大程度的改变。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,流动相的优化,流动相的优化主要是考察流动相组成对保留时间、分离因子和分离度等参数的影响。 使用混合溶剂最大优点是：获得最佳的分离选择性；保持流动相的低粘度, 从而保证高的柱效。,在吸附色谱中混合溶剂选择规则：混合溶剂中极性强的组分含量大或小时, 有最大的值；能与溶质发生氢键作用的溶剂, 有较好的分离选择性。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,4.流动相的组成,水相 纯水 缓冲溶液 有机相 纯有机相 混合有机相 缓冲有机相,妩媚人生 http:/www.5may.net/,妩媚人生 http:/www.5may.net/,对溶剂的要求,水： 去离子水 自动纯水仪 重蒸水 重蒸水装置 纯净水 商品瓶装水 有机溶剂: 色谱纯（国产、进口、进口分装） 重蒸 旋转蒸发仪,妩媚人生 http:/www.5may.net/,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,水,妩媚人生 http:/www.5may.net/,有机溶剂,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,妩媚人生 http:/www.5may.net/,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,妩媚人生 http:/www.5may.net/,水 / MeOH梯度 ODS 柱,1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins.,鬼峰的出现,妩媚人生 http:/www.5may.net/,流动相溶剂的处理,水 将一般的蒸馏水，加入少许高锰酸钾，在pH910的条件蒸馏，可用于常规洗脱。 用于梯度洗脱的水，应进行二次蒸馏。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,妩媚人生 http:/www.5may.net/,有机溶剂的提纯 用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。 氧化铝或硅胶柱可除去溶剂中的极性化合物。 氯仿中（少量甲醇）先水洗，再蒸馏。 四氢呋喃（抗氧剂丁基甲苯酚）而强烈吸收紫外线，可蒸馏。 为了防止爆炸，蒸馏终止时，在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。,妩媚人生 http:/www.5may.net/,过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意： 1）每天脱气 2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长,过滤与脱气,妩媚人生 http:/www.5may.net/,妩媚人生 http:/www.5may.net/,流动相过滤器,负压抽吸,妩媚人生 http