实验六 植物组织中DNA的提取和分析,（P162）,一、目的,掌握植物组织中DNA提取的原理和方法。 掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法。,二、原理,DNA是遗传的物质基础，分离纯化DNA是研究基因结构与功能的首要前提。 细胞内DNA是与蛋白质结合存在的。 在提取DNA的过程中必须将其中的蛋白质降解除去 同时需要尽可能保证其DNA分子的完整性 因此提取时应注意： 在温和的条件下进行提取； 注意避免核酸内切酶引起DNA的降解； 酸、碱和离子强度等化学因素，以及温度、机械张力、剪切等物理因素可引起DNA的降解。,二、原理,植物组织中制备基因组DNA一般有下列几个策略： 细胞壁的破碎 通常将植物组织放在研钵中与液氯或干冰一起研磨，形成粉末。 保持在冰冻状态研磨以避免DNA的降解 细胞膜的破坏 常用去污剂(如SDS或CTAB)。 保护DNA免受内源核酸酶的破坏 去污剂的加入及EDTA的存在都能破坏或抑制酶的活性，EDTA是种螫合剂，它能结合大多数核酸酶的辅因子Mg2+。 用氯仿和苯酚乳化DNA提取液，使蛋白质变性，分离蛋白质和DNA。,尽量减少DNA的断裂 即使溶液的振荡也会使DNA断裂 除去多糖 高等植物材料往往含有多糖，而多糖常常是某些限制酶或连接酶的抑制剂 氯化铯密度梯度离心法 CTAB的核酸提取法也可得到纯的高相对分子质量的DNA，它利用核酸和多糖在CTAB存在时溶解度不同而分离。,二、原理,二、原理,提纯的DNA为白色纤维状固体 利用DNA易溶于盐溶液，微溶于水，不溶于一般有机溶剂（异丙醇、乙醇）的性质对其进行纯化。 DNA分子在一定pH值缓冲液中带有电荷 利用电泳可对其进行分离和研究。 从植物幼苗、嫩叶中制备DNA产率高,三、材料、仪器设备及试剂,材料 小麦幼苗 仪器设备 高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、紫外灯、低温冰箱、微波炉、凝胶成像系统；三角瓶、烧杯、量筒、微量移液器、研钵、离心管 试剂 CTAB提取缓冲液：100 mmolL Tris-HCI（pH值为8.0）；20mmolL EDTA；1.4mol/L氯化钠。 TE缓冲液：10 mmolL Tris-HCI(pH值为8.0)；1 mmoIL EDTA 氯仿：异戊醇（24：1） 异丙醇 70%乙醇 TAE电泳缓冲液：40 mmolL Tris；20 mmolL HAC；1mmolL EDTA 上样缓冲液,四、实验方法,（一）植物组织中DNA的分离,小麦芽0.1g，装入离心管，冷冻,研磨捣碎,加入0.5mLCTAB提取缓冲液,65水浴10min，其间缓慢颠倒3次,加等体积氯仿：异戊醇，缓慢颠倒混匀，冰浴5min,8000rpm，10min,将上层水相移入另一离心管,加0.7倍体积预冷异丙醇，冰浴5min,8000rpm，10min,弃上清，沉淀用0.5ml70%乙醇悬浮,弃上清，风干，加20LTE溶解沉淀，即得DNA溶液,8000rpm，10min,四、实验方法,（二）DNA的电泳分析,制胶 制备0.8%的琼脂糖凝胶 上样 每个点样孔中加10LDNA样品和2L上样缓冲液 电泳 以5V/cm的电场强度电泳30min，溴酚蓝为示踪染料 染色 电泳结束后，将凝胶放入溴化乙锭溶液染色20min 紫外灯下观察结果,五、实验结果与分析,分析DNA提取过程中各操作步骤的作用。 心得,六、讨论与心得,