对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计实验目的：1.利用软件 Vector NTI Explore 对硫矿硫化叶菌 DNA 序列进行酶切找到含目的基因的比较小的片段2. 利用软件 Vector NTI Explore 进行引物设计引物实验材料：Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）的一段 DNA 序列。实验原理：1. 引物设计的原则：A 长度在 1835bp，GC 含量在 40%60%之间，内部无发卡结构，Tm 值最好接近 72；B 引物之间避免形成二聚体；C 引物 3端和模板之间不应少于 12 个连续碱基相匹配；D 在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时需要在引物的3端加上适当的酶切位点。E. 引物 3端不能选择 A，最好选择 T。F. 引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰。 引物的 5 端决定着 PCR 产物的长度，引物 5 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+ 等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等实验内容：试验中用到古生菌的序列长 12389bp，其中 80-709bp 是我们需要的未知功能蛋白质的基因序列，利用 Vector NTI Explorer 分析酶切位点，依次用 PStI、 EcoRI 和ClaI 处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电泳分离目的 DNA 片段，最后得到 11429 的 DNA 片段，是理想的 PCR 模板。再次使用 Vector NTI Explorer 分析，设计 9 的 PCR 引物，使用 PCR 扩增得到目的 DNA。1, 首先我们要用限制性内切酶将冗余的片段切去。找目的基因所在的片段712389 bpPstI (370)ClaI (2372) ClaI (174)HindII (2494)HindII (2828)HindII (306)HindII (384)HindII (7373)NcoI (4042)NcoI (6593)NcoI (7472)NcoI (1043)NcoI (1425)EcoRI (1429)EcoRI (2696)EcoRI (3259)EcoRI (5730)EcoRI (5748)EcoRI (6201)SmaI (7369)SmaI (7492)SmaI (7560)SmaI (9182)SmaI (9210)SmaI (9867)SmaI (1687)XmaI (7367)XmaI (7490)XmaI (758)XmaI (9180)XmaI (9208)XmaI (9865)XmaI (1685)AvaI (368)AvaI (7367)AvaI (7490)AvaI (758)AvaI (7827)AvaI (808)AvaI (801)AvaI (9142)AvaI (9180)AvaI (9208)AvaI (9597)AvaI (9865)AvaI (134)AvaI (1434)AvaI (1685)AvaI (12094)这是 Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌） DNA 序列利用软件 Vector NTI 所能找到的所有酶切位点：因为该物种中限制性内切酶 PstI 只有一个切点，且位于 3370bp 处，可以一次性出去一大段多余的部分，所以先用 PstI 酶切并进行电泳，选择琼脂糖凝胶进行电泳，结果如下图：11 3 0 0 7 0 0 2 K5 K1 0 K2 0 K1 0 0 K1 0 M电泳中 DNA 片段越大则跑的越慢， DNA 片段越小跑得越快，所以 03370bp应该跑得比另一条带快，可以回收跑得最远的那条带，那段序列应该是13370bp 。8370 bpAvaI (368)ClaI (2372)PstI (370)EcoRI (1429)EcoRI (2696)EcoRI (3259)HindII (2494)HindII (2828)HindII (306)，11 3 0 0 7 0 0 2 K5 K1 0 K2 0 K1 0 0 K1 0 M为了一步就能得到我们想要的目的片段，在13370bp 处，用 EcoRI和 ClaI 双酶切再进行电泳，这样做的目的在于可以一步就能得到我们想要的目的片段，而且电泳后的条带清晰，在实验室中好回收。而用这两种酶切产生的片段长度分别1429bp ， 943bp ， 342bp ，563bp ， 111bp ，电泳结果如图：同理， 我们将 1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是我们需要的含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶切位点AvaI， 如图9所示。用工具找它的ORF，ORF的分析结80709bp处，91430 bpAvaI (368)1 AAAATCTTCC AATTATTTCA GTAGTGTCTA TCTTTTAATA TGAAAAATTT TTGATGTTTT AGTTTGAAAA ATTTATTAAG TGAGAAAACA ACTCTCTATTTTTTAGAAGG TTAATAAAGT CATCACAGAT AGAAAATTAT ACTTTTTAAA AACTACAAAA TCAAACTTTT TAAATAATTC ACTCTTTTGT TGAGAGATAA101 GGAATGAAGA ATCTTTATAA AATTAACTTT TCAATATCAC ACCAAGGTTG CTGGACCAGC AAAATAAAAG ATAGTGTTGT TACCTTAAAT GTATCAAAATCCTTACTTCT TAGAAATATT TTAATTGAAA AGTTATAGTG TGGTTCCAAC GACCTGGTCG TTTTATTTTC TATCACAACA ATGGAATTTA CATAGTTTTA201 ATAATAATAA GAAAGTCAGA GTCACAATAG CTTCTCCAAA ATTAATAGTA ACTGACCTAA AAAGGTCAGA AAACGTTTAC GAAATTCTAA AGTATAGAAATATTATTATT CTTTCAGTCT CAGTGTTATC GAAGAGGTTT TAATTATCAT TGACTGGATT TTTCCAGTCT TTTGCAAATG CTTTAAGATT TCATATCTTTAvaI301 GGTAAAAGGG GGTTATATAA TTGACTTCCT TGAAGATCTG AGTACTACAA TTTCAGGATA TATACTCTCG AGCAGTAATA TATTAGAATA TAGAAATGTCCCATTTTCCC CCAATATATT AACTGAAGGA ACTTCTAGAC TCATGATGTT AAAGTCCTAT ATATGAGAGC TCGTCATTAT ATAATCTTAT ATCTTTACAG401 GTAAGGGAAG GAATAGAAAA GTGGGAAGTA ACAACTTTAG CCAAATCTTT AGTAGGCAAA TTATCAGAAA GATTTCCCAT AGATAGCATT GTAGTTAAAGCATTCCCTTC CTTATCTTTT CACCCTTCAT TGTTGAAATC GGTTTAGAAA TCATCCGTTT AATAGTCTTT CTAAAGGGTA TCTATCGTAA CATCAATTTC501 AAATAAAGTT TTCAGATATG TTCTATAATG GTTTGACAGA AAAGGAGATA CTAGTCCTAA AAACCGCAAT AACTATGGGA TATTTCAATT ATCCAAGGCATTTATTTCAA AAGTCTATAC AAGATATTAC CAAACTGTCT TTTCCTCTAT GATCAGGATT TTTGGCGTTA TTGATACCCT ATAAAGTTAA TAGGTTCCGT601 AATAAAAGCT AAGGAAATTG CTGAAAAATT AGGTATCTCC AAGCAAGATT TCCTTTATCA TCTGCGAAAA TCAATAGAGA AAATAATTTT CTCATCAGTTTTATTTTCGA TTCCTTTAAC GACTTTTTAA TCCATAGAGG TTCGTTCTAA AGGAAATAGT AGACGCTTTT AGTTATCTCT TTTATTAAAA GAGTAGTCAA701 ATAGAATAGT AATTCATGCA TATTAAATTA CTAAAAATTT AAGTGATTAA AAAGGTTTAA AAATAATATA AGACTCCTTT ATATTCAAAG ACTATAATCATATCTTATCA TTAAGTACGT ATAATTTAAT GATTTTTAAA TTCACTAATT TTTCCAAATT TTTATTATAT TCTGAGGAAA TATAAGTTTC TGATATTAGT801 CCGAACTTCT TAATTCTGTC TGGAAATCTG CTCTTTATCA CATAATATGT AATTATGTGA ATCAAAAGAA TAGCCCAAGC TGCATAAACT GCTATATTTAGGCTTGAAGA ATTAAGACAG ACCTTTAGAC GAGAAATAGT GTATTATACA TTAATACACT TAGTTTTCTT ATCGGGTTCG ACGTATTTGA CGATATAAAT901 ATGGGAAAGC TGGCGCAGGG TAAGTACCAA AATATATTAC AGCAATATAT AATAGTATTG AAATTATCGG TATCACTACG TGTTTCGCTA TGTTAGCCGTTACCCTTTCG ACCGCGTCCC ATTCATGGTT TTATATAATG TCGTTATATA TTATCATAAC TTTAATAGCC ATAGTGATGC ACAAAGCGAT ACAATCGGCA1001 ACGCATTTTA ACCTTACGTA CAATTAACCC TAAGGCAGCA AATAAATGAC CTAAGGCGAC GTAGAATGAG CCAAATGTTA TTAAAAATAT ACTAGCCTCTTGCGTAAAAT TGGAATGCAT GTTAATTGGG ATTCCGTCGT TTATTTACTG GATTCCGCTG CATCTTACTC GGTTTACAAT AATTTTTATA TGATCGGAGA1101 AACGGACCTA GAATGTAACC ACTTATAAGG CTAAGAGCAC CTGTAACAAT ACCAGTAAGT ATTATTGCAT TACCCGGCAC ACCGTATTTA TTAACTTTTGTTGCCTGGAT CTTACATTGG TGAATATTCC GATTCTCGTG GACATTGTTA TGGTCATTCA TAATAACGTA ATGGGCCGTG TGGCATAAAT AATTGAAAAC1201 AAAAGACTTT AGGATATAAT ACACCATCCC TAGCCATACC GAATATCATT CTACTCCCAC TAGTAGCAAA CGCTAATGCA GAAGAGTTAA ACATAAACGCTTTTCTGAAA TCCTATATTA TGTGGTAGGG ATCGGTATGG CTTATAGTAA GATGAGGGTG ATCATCGTTT GCGATTACGT CTTCTCAATT TGTATTTGCG1301 TAC