选修3 专题1 基因工程,考点一 基因工程的工具 【核心知识通关】 1.限制性核酸内切酶(限制酶)： (1)来源：主要从_生物中分离纯化而来。 (2)功能：_双链DNA分子的某种特定核苷酸序列， 并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_ _断开。,原核,识别,磷酸,二酯键,(3)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数 个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条_， 如 ，以_为轴，两侧碱基互补对称，如 以 为轴，两侧碱基互补对称。,中心轴线,中心线,(4)切割后末端的种类。,2.DNA连接酶：,EcoliDNA,T4DNA,黏性末端,黏性末端和,平末端,磷酸二酯键,3.载体：,双链环状,限制酶,标记基因,(2)其他载体：噬菌体衍生物、_等。 (3)具备的条件。 能在宿主细胞内_并大量复制。 有_切割位点，以便与外源基因 连接。 具有特殊的_，以便进行筛选。,动植物病毒,稳定保存,一个至多个限制酶,标记基因,(4)作用。 作为_，将目的基因转移到宿主细胞内。 利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量_。,运载工具,复制,【特别提醒】 限制酶和DNA连接酶的关系 (1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。,(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 (3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。,【思维拓展】与DNA有关的四种酶,【高考模拟精练】 1.(2012全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下列问题： (1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有_和_。,(2)质粒运载体用EcoR切割后产生的片段如下： AATTCG GCTTAA 为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是_。,(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即_DNA连接酶和_DNA连接酶。 (4)反转录作用的模板是_，产物是_。若要在体外获得大量反转录产物，常采用_技术。 (5)基因工程中除质粒外，_和_也可作为运载体。,(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_ _。,【解题指南】解答本题需明确四点： (1)限制性内切酶的作用和特点。 (2)DNA连接酶的种类。 (3)运载体的类型。 (4)受体细胞的选择原理。,【解析】(1)当限制性内切酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制性内切酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 (2)为使运载体与目的基因相连，不同的限制性内切酶应该切出相同的黏性末端。,(3)DNA连接酶根据其来源的不同分为两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为EcoliDNA连接酶，另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。 (4)反转录是指以RNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA的过程，可以在体外短时间内大量扩增DNA的技术叫PCR(多聚酶链式反应)。,(5)基因工程中可以作为运载体的除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 (6)大肠杆菌细胞有细胞壁和细胞膜，能阻止质粒(外源DNA)等物质的进入，只能通过Ca2+处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)才能作为受体细胞。,答案：(1)黏性末端 平末端 (2)切割产生的DNA片段末端与EcoR切割产生的相同 (3)Ecoli T4 (4)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR (5)噬菌体的衍生物 动植物病毒 (6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱,【延伸探究】 (1)若把平末端连接起来，应该选用什么酶？ 提示：T4DNA连接酶。 (2)切割载体和目的基因的酶是否必须选择同一种酶，原因是什么？ 提示：不必。只要两种酶切割产生的末端相同即可。,2.(2016西安模拟)正常细胞中含有抑癌的P53基因，若它失活而不能表达，则基因突变的细胞易形成肿瘤。基因治疗肿瘤是根本的方法，腺病毒以其嗜好增殖细胞和对人体基本无害而成为良好的基因载体。野生型腺病毒含有抑制P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1，因此需要重新构建有疗效的、安全的腺病毒。图甲、乙中箭头所指为相应限制酶切点。,(1)构建重组腺病毒时，限制酶最好选择_ _，这样既可以去除_基因以防止病毒复制后损伤健康细胞，同时还能破坏_基因以防止其_。,(2)将目的基因与腺病毒重组时，重组的成功率较低，依然还有大量非重组的野生型病毒的DNA，这是因为_。 (3)某DNA分子片段含有1 000个碱基对(即bp)。经扩增后，通过只用限制酶EcoR与同时用EcoR和Hal两种方法切割，其电泳结果如图丙所示，可推断限制酶Hal在该DNA片段上的切割点有_个。,【解析】(1)根据题干信息“野生型腺病毒含有抑制 P53基因活性的55Kda基因，以及病毒复制基因E1”， 构建基因表达载体时，应选用EcoR和BamH切割载 体和含有目的基因的DNA，这样既可以去除E1基因以防 止病毒复制后损伤健康细胞，同时还能破坏55Kda基因 以防止其抑制P53基因的活性。(2)由于切下的片段有 可能与原基因重新结合，因此将目的基因与腺病毒重,组时，重组的成功率较低，依然还有大量非重组的野 生型病毒的DNA。(3)只用限制酶EcoR切割能产生 700 bp、200 bp和100 bp三种长度的DNA片段，同时 用EcoR和Hal两种酶切割可产生420 bp、280 bp和 100 bp三种长度的DNA片段，可见，限制酶Hal又将 长度为700 bp的DNA片段切成420 bp和280 bp两段，将 长度为200 bp的DNA片段切成100 bp的两段，由此可推 断限制酶Hal在该DNA片段上的切割位点有2个。,答案：(1)EcoR和BamH E1 55Kda 抑制P53基因的活性 (2)切下片段有可能与原基因重新结合 (3)2,【方法技巧】限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。,应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。 不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。,(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。 质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。,【加固训练】 1.图甲表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图乙表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp、BamH、Mbo、Sma4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题：,(1)图甲的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由_连接。 (2)若用限制酶Sma完全切割图甲中DNA片段，其产物长度为_。,(3)若图甲中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子分离出图甲及其对应的DNA片段，用限制酶Sma完全切割，产物中共有_种不同DNA片段。,(4)若将图乙中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行重组，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是_。在导入重组质粒后，为了筛选出含质粒的大肠杆菌，一般需要用添加_的培养基进行培养，用影印法接种到只含_的培养基中培养，可进一步筛选出含重组质粒的受体细胞。,(5)假设用BamH切割DNA获取目的基因，用Mbo切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，能否用BamH？_。为什么？_ _ _。,【解析】(1)DNA单链中相邻两个碱基之间通过“脱氧 核糖-磷酸-脱氧核糖”连接。(2)Sma识别的序列为 CCCGGG，切割会产生平末端；图甲中DNA片段含有两个 Sma识别位点，第一个识别位点在左端534 bp序列向 右三个碱基对的位置；第二个识别位点在右端658 bp 序列向左三个碱基的位置，从而两个位点切割后产生 的DNA片段的长度分布为534+3，796-3-3，658+3，,即得到的DNA片段长度为537、790、661。(3)基因D的 序列中含有两个识别位点，经过Sma完全切割会产生 537 bp、790 bp和661 bp三种不同长度的片段，基因d 的序列中含有一个识别位点，经过切割后会产生 1327 bp和661 bp两种长度的片段。(4)能够获取目的 基因并切开质粒的限制酶有识别序列为GGATCC的BamH 和识别序列为GATC的Mbo，若使用Mbo会同时破坏,质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因，所以要用BamH来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的抗生素B抗性基因，便于筛选出含有重组质粒和质粒的大肠杆菌；再用影印法接种到只含抗生素A的培养基中培养，重组质粒的受体细胞死亡，可进一步筛选出含重组质粒的受体细胞。(5)见答案。,答案：(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖 (2)537 bp、790 bp、661 bp (3)两 (4)BamH 抗生素B 抗生素A (5)不能 因为用BamH切割DNA获取目的基因，用Mbo切割质粒，然后形成重组质粒，用BamH不一定将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，因为目的基因和抗生素B抗性基因拼接处含有GATC，不一定出现GGATCC,2.如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：,(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是_，二者还具有其他共同点，如_，_(写出两条即可)。 (2)若质粒DNA分子的切割末端为 ，则与之连接的目的基因切割末端应为_；可使用_把质粒和目的基因连接在一起。,(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为_，其作用是_。 (4)下列常在基因工程中用作载体的是( ) A.苏