1遗传性对称性色素异常症一个家系 DSRAD 基因突变分析作者：李敏，王丽君，张彩娥，吴雄文，邓云华 【摘要】 目的： 通过对一遗传性对称性色素异常症家系的致病基因 DSRAD进行检测，以期寻找到新的致病突变. 方法： 采用 RTPCR 方法从人外周血中获得 DSRAD 基因 cDNA，然后克隆至 pTA2 vector,经阳性克隆筛选后进行基因序列测定，通过 BLAST 程序网上比对找出可能突变位点，再采用单链构象多态性技术进行新突变验证. 结果： 对该家系 DSRAD 基因测序发现患者存在碱基替换A1167G(Q389Q)，由于编码的氨基酸未改变，均为谷氨酰胺，为一种同义突变. 经单链构象多态性分析证明该突变只存在于该家系患者，不存在于家系健康人和100 名无亲缘关系对照者. 结论： 该同义突变可能导致患者皮肤色素异常改变，其具体的机制尚需进一步研究. 【关键词】 遗传性对称性色素异常症；突变；DSRAD 基因；cDNA 克隆；聚合酶链反应；多态现象，单链构象0 引言遗传性对称性色素异常症(dyschromatosis symmetrical hereditaria, DSH)， 1924 年首先由 Toyama 等在日本报道. 该病主要发生于日本和中国，另外韩国、印度、欧洲和北美也有少量报道1. DSH 多为常染色体显性遗传，具有较高的外显率，亦有散发患者和常染色体隐性遗传的报道2 ，其发病机制尚不清楚. 近年来，国内外多个研究小组对该症进行了系列遗传学研究，最终确定了其致病基因为双链 RNA 特异性腺苷脱氨酶(double stranded RNA specific adenosine deaminase, DSRAD)3. 到目前为止，在 DSH 患者中共发现 40 余种 DSRAD 基因的突变. 为完善该症的突变谱，我们对一个 DSH 家系的 DSRAD 基因进行了突变检测，研究 DSRAD 基因的突变位点在皮肤的色素代谢中可能起到的作用.1 对象和方法1.1 对象本研究中家系 3 代，共 11 人，其中 6 例患者（图 1）. 先证者: 女,9 岁，体格发育和智力与同龄人相仿, 未发现明显的系统症状. 3 岁时出现手背散在色素减退斑，随着年龄增大，色素减退斑越来越明显，并夹杂色素沉着斑点，皮损缓慢蔓延，目前已侵及手腕部及右脚踝，皮损夏季明显而冬季减轻. 先证者的母亲(II2) 自述 3 岁左右开始出现皮损，目前色素异常性皮损主要位于手足背，呈对称性分布，面部有少量雀斑样皮损. 先证者的舅舅(II1) 及其儿子(III2) 女儿（III3 ）有类似表型，于四肢末端陆续出现深浅不一的色素减2退斑，间杂褐色斑片,其临床表现符合 DSH. 所有患者黏膜、指(趾)甲、牙齿和毛发均正常.图 1DSH 家系图1.2 方法1.2.1 遗传物质的获取获得知情同意后，无菌采集该家系成员静脉血 5 mL，常规提取基因组 DNA；同时还采集先症者与一名正常家系成员静脉血 5 mL以提取 mRNA. 100 名对照（以排除可能存在的基因多态性）来自湖北及周边地区的正常人，未发现有色素异常.1.2.2 引物设计与合成根据 GenBank 中公布的人 DSRAD 基因的 cDNA 序列通过 Primer5.0 软件设计 3 对 PCR 特异性引物扩增该基因全长，由上海英骏生物技术有限公司合成. 引物序列如下：第 1 对：上游引物 P1：5 GGAGTAGCGGAGGCGTGG 3，下游引物 P2：5 CTTGCTGGTTCTGGTCTGGC 3；第2 对：上游引物 P1：5 GTGGAGAATGGGCAGGAA 3，下游引物 P2：5 AGCAAGGAGGGCTGGAAG 3；第 3 对：上游引物 P1：5 TCTCACTGGCAGCACCTT 3，下游引物 P2：5 CCATCTGTCACTGGAGCAT 3. 扩增片段大小分别为 1400, 1400 和 1290 bp.依据比对分析结果，拟对突变部位进行单链构象多态性分析的引物序列为：上游引物 P1: 5 TTGACAGACAAGAAGCGAG 3，下游引物 P2: 5 CTGCCCATTCTCCACTTT 3. 其扩增产物长度是 177 bp.1.2.3RTRCR 扩增 DSRAD 基因分离白细胞，用 TrizoL 一步法抽提基因组mRNA，按照逆转录试剂盒将总的 mRNA 反转录为 cDNA，以 cDNA 为模板进行 PCR扩增，PCR 反应体系包 4 L 5buffer(含 Mg2+)， 2 L dNTP，4 L cDNA，上下游引物各 1 L，1.5 L Tag 酶，加双蒸水至 20 L. PCR 反应条件为 96预变性 3 min, 然后 96变性 1 min,退火 55 60 s,延伸 72 2 min,共30 个循环，最后 72延伸 10 min. PCR 产物取 5 L 以 10 g/L 的琼脂糖电泳，Goldview 染色，凝胶电泳图像分析系统分析鉴定.1.2.4DSRAD 基因的克隆将 DSRAD 基因 PCR 产物通过 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切取含有目的条带的琼脂糖凝胶块，按胶回收试剂盒说明书中的方法,回收胶块中的目的片断，将回收产物与 pTA2 载体于 16连接 18 h，取连接产物 10 L 加至 100 L 感受态 DH5a 大肠杆菌，冰浴 30 min，42热击 90 s,再冰浴 2 min 后加入 800 L 的 LB 培养液 37振摇 45 min，取菌液 200 L涂布于含有氨苄青霉素，Xgal 和 IPTG 的 LB 平板 37过夜，次日经蓝白筛选,随机挑取 5 个白色菌落,分别转种含氨苄青霉素 100 mg/L 的 3 mL LB 培养基，37振摇 6 h 后, 分别以 DSRAD 引物进行菌落 PCR，鉴定出目的基因的阳性克隆.1.2.5DSRAD 的序列测定与分析将经过鉴定的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行双向反应测序，将测序结果通过 BLAST 程序网上比对找出可能的突3变位点.1.2.6 单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism analysis, SSCP) 在 DSRAD 基因上设计一段包含突变位点的 177 bp 的片段用于PCRSSCP 分析，同时对 100 个正常人的 DNA 进行同样条件的 SSCP 分析. 将 PCR扩增产物变性 5 min,立即冰浴 10 min，使用 12 mol/L 非变性聚丙烯酰胺凝胶，于 4，80 V 电泳 6 h 后银染，观察有无异常条带. 2 结果本研究采用 RTRCR 法克隆 DSRAD 基因后，将测序结果通过 BLAST 比对，发现 DSRAD 基因的第 1167 位碱基(以起始密码子 ATG 之 A 为第一位)存在可疑突变，该位点腺嘌呤（A）转换成鸟嘌呤（G） ，导致第 389 位密码子由CAACAG（图 2） ，但编码的氨基酸未改变，均为谷氨酰胺(Q389Q). SSCP 分析发现该家系患者存在异常电泳条带（图 3） ，家系正常成员和 100 名无亲缘关系的正常人无此改变.3 讨论该家系临床诊断为 DSH，具有典型的临床表现和常染色体显性遗传特征. 本病主要鉴别诊断为遗传性弥漫性色素异常(DUH)，后者曾被认为是 DSH 的另一种亚型，但目前研究已经证实二者具有不同的分子遗传学基础4.2003 年高敏等4将本病定位在 1 号染色体长臂 1q111q21 的 11.6 厘摩的区间内；同年 Miyamura 等3发现了本病的致病基因是位于该区间的DSRAD，又称 ADAR 基因，该基因是 ADAR 家族中的一员，该家族成员广泛存在于从线虫到人的各种生物中，其主要生物学功能包括 RNA 编辑和诱导蛋白质在核内的翻译. 基因全长约 30 kb,共有 15 个外显子，最长的转录本约 6.7 kb，编码含有 1226 个氨基酸序列的双链 RNA 特异性腺苷脱氨酶，该酶可选择性地将PremRNA 上的腺嘌呤核苷(A)脱氨基转换成次黄嘌呤核苷(I)，后者在碱基配对中相当于鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)配对，导致转录的 mRNA 所翻译的氨基酸序列与DNA 所对应的有所不同，并产生特定的生理效应5. 已有研究证实该酶有 3个功能域,依次为 2 个 Zalpha 区，是 2 个 ZDNA 结合功能域，引导该蛋白靠近正在转录的 DNA，以便对底物 RNA 发生作用6 ；3 个双链 RNA 结合亚区，由2 号外显子到 7 号外显子所编码，主要进行识别底物并结合底物的作用；1 个腺苷脱氨催化区，由 8 号外显子到 15 号外显子的起始区域编码，实现腺苷的脱氨基作用7. Cho 等8通过对 DSRAD 蛋白的研究发现该酶是以二聚体的形式发生活性作用的，其蛋白单体的 N 末端和第一个双链 RNA 结合功能域是形成二聚体的关键. 若突变的染色单体编码了一个缺陷的蛋白，不能形成有效的二聚体形式，无法发挥其正常功能，即可能导致疾病的发生.自该疾病致病基因发现以来，不断的有基因突变的报道. 常见的突变类型是点突变，多为错义突变，其次是碱基缺失或插入，可引起移码突变或无义突变，鲜见有同义突变的报道. 本实验研究采用 RTPCR 方法对 DSRAD 基因进行了全克隆与序列测定，再以 PCRSSCP 技术进行突变鉴定，发现该家系中所有患者存在第 1167 位碱基(2 号外显子第 1136 碱基)由 A 替换为 G，家系正常成员和 100 名4无亲缘关系的正常对照均不存在此改变，由于该突变并不引起所编码的氨基酸的改变，均为谷氨酰胺，为一同义突变. 同义突变虽未改变氨基酸的序列，但核酸改变可能影响转录效率，并且同一氨基酸其简并密码子的翻译效率不同，可能使蛋白质表达量改变，最终导致疾病的发生9. 该同义突变是否影响 DSRAD 基因功能尚需进一步研究.DSRAD 基因的突变分析，为遗传性对称性色素异常症提供了从分子水平确诊的新技术，对临床拟诊的遗传性对称性色素异常症患者及其亲属进 DSRAD 基因的检测，不但可以对典型的患者作出诊断，而且对轻型及无症状者可以做到早期诊断，有利于在家系内开展有效的遗传咨询.【参考文献】1 Oyama M, Shimizu H, Ohata Y, et al. Dyschromatosis Symmetrica hereditaria(reticulate acropigmentation of Dohi): Report of a Japanese family with the condition and a literature review of 185 casesJ. Br J Dermato1, 1999,140(3):491-496.2 Alfadley A, Al Ajlan A, Hainau B, et al. Reticulate acropigmentaion of Dohi: A case report of autosomal recessive inheritanceJ. J Am Acad Dermatol, 2000,43(1 Pt 1):113-117.3Miyamura Y, Suzuki T, Kono M, et al. Mutations of the RNAspecific adenosine deaminasegene (DSRAD) are involved in dyschromatosis symmetrica hereditaria J. Am J Hum Genet, 2003,73(3):693-699.4高敏，张学军，李明，等. 全基因组扫描定