争花不待叶， 密缀欲无条。 傍沼人窥鉴， 惊鱼水溅桥。,宋 苏轼桃花,基 因 工 程,淮阴师范学院 杨文杰,生物技术专业核心课程,C 用于基因转移的受体菌或细胞,A 用于核酸操作的工具酶,B 用于基因克隆的载体,4 基因工程的基本条件,第二节 基因工程的载体系统,一、克隆载体,(一)载体的功能及特征,载体: 在基因克隆中携带外源基因进入受体细胞的基因工程“运载工具”称为载体。载体的化学本质是DNA。目前基因工程中使用的载体多为经过改造的质粒DNA。,载体的概念,载体应具备的基本特性：,1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)； 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点； 3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点； 4.具有较高的外源DNA的载装能力； 5.具有合适的筛选标记。,(二)质粒载体(Plasmid),1. 质粒的一般生物学特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；,质粒常见于原核细菌和真菌中；,绝大多数的质粒是DNA型的；,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分 子结构，即cccDNA；,质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。,2. 质粒的分类,R质粒：通称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且能够将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。,F质粒：又叫F因子或性质粒，它们能使寄主染色体上的基因和F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞。,Col质粒：即所谓产生大肠杆菌素因子，它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。,3. 质粒的基本特性,（1）自主复制 （2）不相容性 （3）转移性 （4）编码性状,（1）自主复制,质粒DNA上都含有一个复制起始区，控制着质粒在 宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。 一般一个质粒DNA分子上只含有一个复制子。,不同质粒在宿主内复制的程度相差较大，体现在单 个细胞内的质粒拷贝数上，最多的可高达700个/细胞， 最低的在每个细胞中只维持有一个质粒分子。,ori,E.coli ColE1 plasmid,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,拷贝数的控制机制质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,复制方向,按复制能力可将质粒分为两种类型：,严紧型（Stringent plasmid): 低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-3个质 粒分子,松弛型（Relaxed plasmid): 高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可含高达10-60 个质粒分子,（2）质粒的不相容性,质粒的不相容性(Plasmid incom-patibility)： 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不 同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现 象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质 粒。,不相容性的质粒组成不相容性群,目前，在大肠杆 菌质粒中至少已鉴定出了30个以上的不亲和群。,质粒的接合转移,接合型质粒:能在自然条件下自发地从一个细胞转移 到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；,（3）质粒的转移,非接合型质粒:不能在自然条件下独立地发生接合作 用如Col、R的其它成员。,性须,质粒的迁移作用（Mobilization)：非接合型的质粒 由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因， 因而不能自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一 种接合型的质粒，它们通常也是可以被转移的。这种 由共存的接合型的质粒引发的非接合型质粒的转移过 程，如ColE1质粒。,质粒的迁移作用,（4）编码性状,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。,物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有 机物；,物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱。,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,4. 质粒载体的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数 低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不 能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生 型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由 少数几个野生型质粒构建的。,pSC101：8.8 kb，拷贝数5，四环素抗性标记基 因 Tcr,ColE1：6.5 kb，拷贝数20-30，大肠杆菌内毒素 标记基因 E1,RSF2124：ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标 记基因 Apr,多克隆位点(Multiple Cloning Sites, MCS),现在几乎所有的载体都含有一个人工合成的密 集排列的系列克隆位点，称为“多接头”、“限制 酶切位点库”或“多克隆位点”。,在质粒载体内引入适宜的限制性核酸内切酶位 点，以方便外源DNA片段的插入。,标记基因(Marker Gene),按其用途可将标记基因分为选择标记基因和 筛选标记基因。,选择标记基因用于鉴别目标DNA(载体)的存 在，将成功转化了载体的宿主挑选出来；,筛选标记基因可用于将携带了外源DNA片段的 重组子挑选出来。,选择标记基因,1.氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin resistance gene, ampr）,2. 四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene, Tcr）,3. 氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr）,4. 卡那霉素基因（Kanamycin resistance gene, Kanr）,筛选标记基因,筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组 质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒 载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源 片段的质粒，即重组质粒。,互补,lacZ,b-半乳糖苷酶的a-肽段,lacZ,b-半乳糖苷酶的b-肽段,b-半乳糖苷酶,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,5-溴-4-氯靛蓝,宿主细胞可编码LacZ酶C端部分序列。虽然宿主 和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融 为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象 叫互补(-complement)。,在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNA的短区段， 其中含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列 和前146个氨基酸的编码序列；,在这一编码区中插入有一个多克隆位点，它并 不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到LacZ酶 的氨基端，而不影响功能；,当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无 互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细菌 形成白色菌落。,由互补而产生的活性蛋白质在诱导物IPTG的存在 下可与生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳 糖苷）反应，因此Lac细菌在含X-gal和IPTG的培养 基上可形成蓝色菌落，易于识别。,人工构建的质粒类型：,高拷贝质粒：突变拷贝数控制基因，拷贝数 1000-3000，扩增基因；,低拷贝质粒：来自pSC101，拷贝数小于10，表 达某些毒性基因；,温敏质粒：在不同温度下表现出拷贝数、整合 等不同性质；,测序质粒：含有测序通用引物互补序列和多酶 接头polylinker；,整合质粒：装有整合促进基因及位点，便于外源 基因的整合；,穿梭质粒：由人工构建的具有两种不同复制起始 点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活 和复制的质粒载体。；,表达质粒：装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件；,探针质粒：装有报告基因，便于启动子等元件的克 隆筛选；,5. 重要的大肠杆菌质粒载体,第一阶段：pSC101和ColE1应用较多，但相对分子 量大且酶切位点少；,第二阶段：pBR322出现后，通过调整载体的结构， 工作效率大大提高；pUC质粒去掉了多余的片段， 添加了多克隆位点和筛选标记等；,第三阶段：在此基础上，又增加了辅助功能，形成 了表达载体和穿梭质粒等功能性质粒。,pBR322：,4363bp；,松弛型复制，50- 100拷贝/cell；,用于基因克隆,30多个单一位点；,具有Tcr和Apr；,pUC18/19：,分子量2686bp；,装有多克隆位点 (MCS)；,正选择颜色标记 lacZ；,用于基因克隆和测序。,Rop基因缺失， 500-700拷贝/cell；,pGEM-3Z/4Z：,拷贝数 2000-3000/cell,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,装有两个噬菌体的强启动子,用于外源基因的高效表达,6. 质粒DNA的分离与纯化,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙 锭污染,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶 法之间,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,在pH值在12.0-12.5之间时，线 性染色体DNA片段会被变性，而闭 合环状的质粒的DNA则不会被变性 或只有少量的氢键断裂;当恢复中 性pH值时便会迅速地复性。,但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅 速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变 性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中 的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。,用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体；,加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,沸水浴40秒钟；,离心，用无菌牙签挑去沉淀物；,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；,(三) 噬菌体载体( Bacteriophage),1.噬菌体的一般生物学特征,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效 率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主 复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来， 而且在一定的条件下上述两种状态还会相互 转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能 被开发成为基因工程的有用载体，因为：,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞 中高效扩增；,大肠杆菌的噬菌体生物结构,噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体；,噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成；,-DNA全长48502个核苷酸；,-DNA上至少有61个基因；,COS,COS,噬菌体生物学特性：感染周期,E.coli,吸附,注入,复制,包装,裂解,噬菌体生物学特性：感染周期,100个左右的拷贝,体内包装,包装范围为原DNA的75-105%,即36-51kb,噬菌体生物学特性：溶原状态,噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也 可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上， 并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态；,整合主要由-DNA上的cI和int两基因的产物所激 活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞 本身的性质；,人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质， 使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；,DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态。,2.-DNA载体的构建,缩短长度,野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为 48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb 时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。,因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载 量。其实野生型-DNA上约有40-50%的片段是复 制和裂解所非必需的。,根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：,具有一个限制性内切酶位点。,具有成对的限制性内切酶位点，在两个位 点之间的DNA区段可以被外源DNA片段取代。,插入型载体,插入位点,载体长度 37kb,体外包装,插入片段,体外包装,插入片段大小： 0-14kb,（5137Kb）,