1胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究作者：张召辉 李 玺 夏安周 路逵阳 陈复兴 【关键词】 胰腺摘 要：目的：寻找更好的胰腺组织单细胞悬液制备方法。方法：以大鼠冷缺血胰腺组织作为标本，分别采用剪碎和研磨法制备胰腺组织悬液。经台盼蓝染色测细胞存活率，并进行流式细胞术分析。结果：剪碎法细胞形态较完整、存活率高；两种方法细胞凋亡水平（APO） 、CV 值有显著性差异（P 0.05） ，而细胞凋亡水平、CV 值匀浆法明显高于剪碎法（P 0.01） ，见表 1。3表 1 不同制备法对细胞 APO、DI、G0/G1、S 和 CV 值的影响（ 略 ）3 讨 论流式细胞术是近年来发展起来的一种细胞的分析新技术，广泛应用细胞凋亡等方面的研究，具有快速、精确、高灵敏、多参数等特点。而单细胞悬液的制备又是进行流式细胞术分析的关键环节，尤其在实体组织分散细胞悬液的制备方面，还有很多问题有待解决，至今尚无一个合适通用的方法。采用何种方法能够获得产率高、活性高、功能强的单细胞，对于进一步的实验研究十分必要。因此，可根据具体的实验目的及不同的组织特点选择合适有效的单细胞悬液的制备方法。目前实体组织细胞悬液制备方法主要有机械法和酶消化法两种，由于胰腺组织中含有较多的纤维组织，本实验在预实验阶段曾采用先加纤溶酶再加胰蛋白酶的酶消化法，但均未获得足够细胞浓度的单细胞悬液（1106） ，这可能与胰腺腺泡细胞中含有大量的消化酶有关。机械法主要给予组织较大的压力，使细胞从组织间释放出来。本实验比较两种制备胰腺细胞悬液的方法，镜下观察剪碎法细胞形态较完整，背景干净，杂质少，细胞存活率高；匀浆法制备的细胞悬液的 DNA直方图质量较差，主峰较宽，主峰前杂乱信号较多；DNA 参数分析，剪碎法细胞凋亡水平、CV 值明显低于研磨法，而 DI、SPF、G0/G1 细胞比率无显著性差异。机械法中研磨法与剪碎法相比，研磨过程中更易损伤较多的细胞，因而易造成胰腺细胞死亡，完整细胞相对较少，细胞存活率较低。研磨过程中受损破坏的细胞及细胞碎片 PI 染色后均可发生低荧光，显示在凋亡峰位置，出现一定假阳性，导致 APO 检出率较高。CV 值包括两部分，一是使用标准品测得的仪器 CV 值与实验样品所测得的 CV 值之和，CV 值越小则曲线分布越窄、越集中，测量误差越小。本实验显示，两种方法的 CV 值有明显差异，剪碎法样品的 CV 值显著低于研磨法。综合以上分析，我们认为酶消化法费时且较难获得足够浓度的单细胞悬液，机械法中，剪碎法制备胰腺组织悬液，不仅比研磨法简便，而且细胞存活率高、检测准确性更好。因此，胰腺组织细胞悬液制备剪碎法优于研磨法。参考文献：1 马文新.流式细胞仪技术与原理J.世界医疗器械，1998，4（4）：28.2 张召辉，李玺，路逵阳等大鼠胰十二指肠移植模型的建立J.徐州医学院学报，2003，23(3)：205-206