第六章 发酵过程控制,发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性 同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的,第一节 发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,一、发酵过程的种类,分批培养 补料分批培养 半连续培养 连续培养,1、 分批发酵 简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,分批培养中微生物的生长,迟滞期,对数生长期,稳 定 期,死亡期,微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期,随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期,对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,优点： 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握 缺点： 产率低，不适于测定动力学数据,分批培养的优缺点：,2、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,补料分批培养的优缺点,优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺,缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,3、半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵,优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量,缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,4、连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。 达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,连续培养的优缺点,优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学,缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加,二、发酵过程工艺控制的目的,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来 目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率,葡萄糖限制条件下的L-色氨酸发酵过程,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,发挥菌种的最大生产潜力考虑之点 菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率 菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行,因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识,微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性 为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,三 发酵过程研究的方法和层次,1、研究方法,单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验 优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。 缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长 各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。 优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。 但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,2、研究的层次 初级层次的研究： 一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。 摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,代谢及工程参数层次研究： 一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,全参数发酵罐除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧、pH电极，得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾气采集分析系统，更重要的是，有一套独特的数据处理软件，软件的开发是长期科研成果的结晶，可以得到14个发酵过程参数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过程的分析起到了重要的作用,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,鸟苷发酵过程曲线,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,生产规模放大： 在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产业化的实现 一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致,发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。 这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等,第二节 发酵过程的中间分析,发酵过程的中间分析,代谢参数按性质分可分三类： 物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等 生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等,发酵过程的中间分析,从检测手段分可分为：直接参数、间接参数 直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等 间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等,发酵过程的中间分析,直接参数又可分为: 在线检测参数和离线检测参数 在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速 离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH3-N、菌体浓度,发酵过程的中间分析,一 发酵过程主要分析的项目,目前发酵过程主要分析项目如下,1、pH pH与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性 pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供氧状况,发酵过程的中间分析,2、排气氧、排气CO2和呼吸熵,排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，通过计算可以求得摄氧率（OUR）。 排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的氧。,发酵过程的中间分析,CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二氧化碳的量,呼吸熵,呼吸熵反映了氧的利用状况,RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的不同而不同。测定RQ值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料,一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在补糖开始时，不但CER、OUR大幅度提高，连RQ也提高约10，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。,发酵过程的中间分析,发酵过程的中间分析,3、糖含量,微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。 糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况 反映产物合成的活力 菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。 糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖。 还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。,发酵过程的中间分析,4、氨基氮和氨氮,氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是 mg/100ml。如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。 氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。 氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。 但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。 发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。,发酵过程的中间分析,5、磷含量,微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。 磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施。,发酵过程的中间分析,6、菌浓度和菌形态 菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。 菌形态 显微镜观察 菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量适合与否的一个参数。,发酵过