http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,第七章 发酵过程的代谢控制,发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性 同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的,发酵过程的代谢控制,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,第一节 发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,一 发酵过程的种类,分批培养 补料分批培养 半连续培养 连续培养,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,1、 分批发酵 简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期,在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。,当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期,对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,分批培养的优缺点,优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握 缺点 产率低，不适于测定动力学数据,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,2、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,补料分批培养的优缺点,优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。,缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,3、半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。某些品种采取这种方式，如四环素发酵,优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。,缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,4、连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。 达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,连续培养的优缺点,优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于D，通过改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学,缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,二 发酵过程工艺控制的目的,有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来 目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,发挥菌种的最大生产潜力考虑之点 菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率 菌代谢与环境的相关性 温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性,因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。 为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,三 发酵过程研究的方法和层次,1、研究方法,单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验 优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。 缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长 各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。 优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。 但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,2、研究的层次 初级层次的研究： 一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适pH等要求。 摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,代谢及工程参数层次研究： 一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较可信。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,我们学院的国家生物工程中心创制的全参数发酵罐除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧、pH电极，得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，补料计量装置和尾气采集分析系统，更重要的是，有一套独特的数据处理软件，软件的开发是长期科研成果的结晶，可以得到14个发酵过程参数，并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过程的分析起到了重要的作用,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,生产规模放大： 在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产业化的实现。 一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。,发酵过程的代谢控制,发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,第二节 发酵过程的中间分析,发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。 这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,代谢参数按性质分可分三类： 物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等 生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,从检测手段分可分为：直接参数、间接参数 直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等 间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,直接参数又可分为: 在线检测参数和离线检测参数 在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速； 离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度。,发酵过程的代谢控制,发酵过程的中间分析,http:/biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc,一 发酵过程主要分析的项目,目前发酵过程主要分析项目如下,1、pH pH与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性 pH的变化又是微生物代谢状况的综合反映基质代谢、产物