1诱骗受体 3 对大鼠移植肝脏的保护作用作者：王槐志 黎万玲 张玉君 陈志宇 朱瑾 郑平 熊燕 董家鸿【摘要】 目的 将重组诱骗受体 3(decoy receptor 3,DcR3)腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)感染移植肝，探讨 DcR3 对移植肝的保护作用。方法 实验动物分为同基因肝移植组(G1)、同种异体肝移植组(G2)、AAV 空病毒感染的同种异体肝移植组(G3)、重组 DcR3/AAV 感染的同种异体肝移植组(G4)。常规建立同种异体大鼠肝移植模型；术中取预先制备的浓缩 1109 IU 病毒颗粒感染移植肝；术后观察大鼠的存活时间、肝功能，荧光显微镜及光镜下观察DcR3 在肝脏中的表达及肝脏病理改变。结果 G4 组的平均生存时间比 G2、G3 组显著延长，G2、G3 组的平均生存时间差异无统计学意义。G4 组大鼠术后 15、20 d 的肝功能、肝脏病理改变分别与 G2、G3 组大鼠术后 7、10 d 相似。结论 DcR3对大鼠移植肝有显著的保护作用。 【关键词】 诱骗受体 3； 肝移植； 保护作用； 大鼠Protective effects of decoy receptor 3 on rat liver allograft【Abstract】 Objective To investigate the protective effect of decoy receptor 3 (DcR3) on rat liver allograft by infecting liver allograft with recombinant human DcR3/adenoassociated virus (AAV). Methods All rats were divided into isogenic liver transplantation group (G1), allogenic liver transplantation group (G2), allogenic liver transplantation group infected by AAV virus (G3) and allogenic liver transplantation group infected by recombinant DcR3/AAV (G4). Rat liver allotransplantation model was established by regular methods. Liver allografts were infected by condensed viral particles (1109 IU) perioperatively. Survival time of rates and liver function were investigated, and the expression of DcR3 in liver allograft and pathological changes of liver were observed under fluorescent microscope and light microscope. Results The mean survival time of rats in G4 was significantly longer than that in G2 and G3, with no statistical difference between G2 and G3. The pathological changes of liver and liver function at postoperative days 15 and 20 of G4 were similar to those at postoperative days 7 and 10 of G2 and G3. Conclusions DcR3 has protective effect on rat liver allograft after liver transplantation.【Key words】 Decoy receptor 3; Liver transplantation; Protective effect; Rats诱骗受体 3(decoy receptor 3，DcR3)有保护移植物免受排斥反应损伤的2治疗潜能1-2 。腺相关病毒(adenoassociated virus，AAV)可作为诱导肝移植耐受时免疫调节或移植物保护分子转染和表达的理想载体3-4 。因此本研究将 AAV 作为其载体转染肝脏，期望实现 DcR3 蛋白在移植肝中的长期表达，为移植肝提供保护作用， 同时避免其全身性的副作用。1 材料与方法1.1 重组 DcR3/AAV 及 AAV 空病毒颗粒取预先制备的浓缩重组 DcR3/AAV 及 AAV 空病毒颗粒 1109 IU，用乳酸林格氏液稀释至 5 ml 备用5 。AAV 病毒中自带的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)可作为 DcR3 表达的标志。1.2 实验动物近交系 DA 大鼠，质量 180200 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供；近交系 Lewis 大鼠，质量 200250 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。所有大鼠均在标准条件下饲养，给予啮齿类动物饲料及饮水，遵守实验动物使用和管理准则。1.3 动物分组同基因肝移植组(G1，n=8)：Lewis 大鼠为供、受体。同种异体肝移植组(G2，n=10)：DA 大鼠为供体，Lewis 大鼠为受体，术后不予任何处理。AAV 空病毒感染的同种异体肝移植组(G3，n=10)：DA 大鼠为供体，Lewis 大鼠为受体。切取供肝之后，将 AAV 空病毒颗粒用乳酸林格氏液稀释至 5 ml 后经门静脉注入肝脏，同时夹闭下腔静脉两端及门静脉保存 30 min，至供肝植入时放开。重组DcR3/AAV 感染的同种异体肝移植组(G4，n=10)：所用病毒颗粒为重组 DcR3/AAV病毒颗粒，余同 G3 组。1.4 动物模型的建立采用经典的二袖套法建立大鼠原位肝移植模型。1.5 标本采集于肝移植术后 1、3、5、7、10、15、20 d 从大鼠尾静脉取 2 ml 抗凝血。于肝移植术后 7、10、15、20 d 麻醉状态下开腹取小块肝脏标本，然后关腹让动物继续生存。1.6 观测指标观察大鼠术后一般情况、存活时间至术后 25 d。术后存活时间超过 24 h视为手术成功。采用 Beckman 全自动生化分析仪检测肝功能。取不同时相点的肝3组织行冰冻切片及常规石蜡切片，同时常规进行苏木精 伊红染色，在荧光显微镜及光镜下观察 DcR3 的表达及肝脏病理改变。1.7 统计学分析结果以s 表示，各组间均数比较采用方差分析。生存时间采用 SPSS 11.5软件绘制成 KaplanMeier 曲线，比较采用对数秩检验(Logrank) 。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 一般情况手术后 5 min 左右，大鼠即清醒、站立，30 min 后能饮水。第 2 天各组大鼠的精神、食欲稍差，活动较少。第 3 天各组大鼠的活动、饮食及精神状况恢复正常。G2、G3 组大鼠第 7 天开始出现皮肤、巩膜黄染，尿液发黄，毛杂乱，精神、食欲差，活动减少。G4 组大鼠则于第 15 天开始出现上述表现。G1 组大鼠未见异常表现。2.2 生存曲线G1 组长期存活，与 G2、G3、G4 组比较差异有统计学意义(2=17.17、17.49、17.69，P0.05)；G2 组平均生存时间(10.90.5)d；G3 组(11.00.6)d；G4 组(20.50.5)d。G4 组比 G2、G3 组显著延长(2=20.67、21.06，P0.05)，G2、G3 组比较差异无统计学意义(2=0.13，P=0.713 6)(图 1)。2.3 肝功能的改变2.3.1 术后 ALT 的变化：各组大鼠肝移植术后第 1 天 ALT 显著升高，至第 5天左右降至正常。G1 组 ALT 一直维持正常至观察结束。G2、G3 组 ALT 自术后第7 天开始显著升高直到受体大鼠死亡。G4 组大鼠 ALT 维持正常，自术后第 15 天开始显著升高直到受体大鼠死亡。2.3.2 术后 TB 的变化：各组大鼠肝移植术后第 1 天 TB 显著升高，至第 5 天左右降至正常。G1 组 TB 一直维持正常至观察结束。G2、G3 组 TB 自术后第 7 天开始显著升高直到受体大鼠死亡。G4 组大鼠 TB 维持正常，自术后第 15 天开始显著升高直到受体大鼠死亡。2.4 病理改变G3、G4 组大鼠除肝脏外其他器官包括肺、心脏、脑、脾、肾、胃肠中始终没有 GFP 表达。G3 组大鼠术后 7、10 d 在荧光显微镜下可见肝脏中有 GFP 表达，在光镜的同一视野下见肝细胞肿胀，小片状坏死(图 2)。G4 组大鼠术后 7、10 d在荧光显微镜下可见肝脏中有 GFP 表达，但在光镜下观察完全正常；术后 20 d在荧光显微镜下仍可见 GFP 表达，在光镜的同一视野下开始见肝细胞大片状坏死4伴有明显的淋巴细胞浸润，汇管区结构紊乱伴有明显的淋巴细胞浸润(图 3)。3 讨论根据 DcR3 的作用机制，我们推测 DcR3 通过下列途经对移植肝功能起到保护作用：与 Fas 竞争性结合 FasL，阻断宿主细胞毒性 T 淋巴细胞通过 Fas/FasL途经杀伤靶细胞6 ；通过阻断 LIGHT 与 LTR 或 HVEM/TR2 的相互作用而抑制LIGHT 诱导的肝细胞坏死7 ；通过阻止 Fas/FasL 的相互作用抑制宿主细胞毒性 T 淋巴细胞的活化，从而减轻宿主细胞毒性 T 淋巴细胞对肝细胞的损伤。本研究结果证实各组大鼠术后第 1 天均出现 ALT、TB 升高，我们认为这与缺血再灌注及手术创伤有关。G4 组大鼠术后出现 ALT、TB 再次升高及肝功能衰竭的时间明显推迟、生存时间显著延长，且其肝脏组织中有 GFP 表达。我们在以往的研究中已经证实重组 AAV 病毒中 GFP 与 DcR3 的表达是一致的，GFP 的表达可以作为DcR3 表达的标志5 。急性排斥反应发生时，宿主细胞毒性 T 淋巴细胞首先穿过血管聚集在汇管区，导致血管内皮细胞及胆管上皮细胞水肿、坏死、脱落，出现血管栓塞、黄疸。若炎症不能控制，则进一步扩散至汇管区以外，造成肝细胞变性、坏死甚至整个肝小叶坏死，从而导致移植肝功能丧失。我们观察到 G4 组大鼠肝脏组织中淋巴细胞的浸润时间延迟、数量减少，病理改变较轻。因此，我们认为 DcR3 在肝脏组织中的表达抑制了移植肝组织中淋巴细胞浸润的速度及数量并降低其对肝组织的破坏程度，从而对移植肝有保护作用，延长了其生存时间。已知FasL、CXCL12/SDF1 对淋巴细胞有强烈的趋化效应8 。因此我们推测 DcR3可能通过与 Fas 竞争性结合抑制 FasL 介导的淋巴细胞向肝脏的迁移、还可通过抑制趋化因子 CXCL12/SDF1 在肝脏的表达来减轻宿主细胞毒性 T 细胞对移植肝的浸润。由于 AAV 基因组可定点整合至 19 号染色体的一个 24 kb 的区域(19q13.32qter)，具有避免插入性突变致肿瘤发生、保证目的基因长期稳定表达的优点9 。既往的研究还证明 AAV 能将目的基因高效率地转入并表达于移植肝中，而肝脏外其他器官中没有目的基因的表达。我们观察到在大鼠死亡之前，重组 DcR3/AAV 感染的 G4 组大鼠肝组织中仍有 DcR3 表达，而肝外器官中始终没有转染的 DcR3 表达。同时我们还证实了其对移植肝有明显的保护作用。因此，我们认为在移植肝存活时间进一步延长的情况下，将 AAV 作为 DcR3 载体也