第八章 微生物的遗传变异和育种,第一节 菌种的衰退、复壮和保藏 第二节 遗传和变异的物质基础 第三节 基因突变和诱变育种 第四节 基因重组 第五节 基因工程,返回主目录,第一节 菌种的衰退、复壮和保藏,一. 菌种的衰退和复壮 遗传性的变异是绝对的；它的稳定性是相对的。 最易觉察的是菌落和细胞形状的改变；生长速度的减缓，代谢能力的减缓（产量少，孢子少。侵染力下降；抗性减低） 正变体；衰退；复壮（狭义和广义）,返回目录,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 原有典型性状的菌种。,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选“正变”个体。,大量群体中的自发突变,菌种的复壮：,a）纯种分离；,b）通过寄主体进行复壮；,菌种衰退的特点：,二、防止衰退的措施,1）减少传代次数；,2）创造良好的培养条件；,3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；,4）采用有效的菌种保藏方法；,三、菌种保藏,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,基本要求：,基本方法：,生活态 休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,第一节 遗传和变异的物质基础 一. 3个经典实验 1、1944年，Avery精确重复了转化实验， 确定了转化因子,实验证明:将R菌转化为S菌的转化因子是DNA,第八章微生物的遗传变异和育种,返回目录,2、噬菌体感染实验,实验证明：进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完 整噬菌体的全部信息。,第八章微生物的遗传变异和育种,二. 遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式 （一）遗传物质在7个水平上的形式 细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核 细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同 染色体水平: 倍性(真核)和染色体数 核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链 基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录翻译 密码子水平： 信息单位,起始和终止, 核苷酸水平： 突变或交换单位，四种碱基,第八章微生物的遗传变异和育种,（三）原核生物的质粒,1、定义 质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进 行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,第八章微生物的遗传变异和育种,2、结构特点 通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；,第八章微生物的遗传变异和育种,3、质粒的类型,严谨型质粒(stringent plasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数 松弛型质粒(relaxed plasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数,窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid) （只能在一种特定的宿主细胞中复制）,广宿主范围质粒(broad host range plasmid) （可以在许多种细菌中复制）,第八章微生物的遗传变异和育种,第二节基因突变和诱变育种,一. 突变生物体的表型，突然发生了可遗传的变化。 (一).基因突变 营养缺陷型 基因突变而丧失合成一种或几种生 长因子的能力类型。 选择性突变 抗性突变型 产生对某种药物或物理因子的抗性 类型 条件致死突变型某种条件可生长，另一种条件死 的类型。 形态突变性 个体或菌落形态所发生的非选择变 化的类型。 非选择性突变 抗原突变型指基因突变引起的抗原结构发生 突变的变异类型。（L型细菌） 产量突变型 指基因突变而获得的在有用代 谢产物产量上高于原始菌株的突变株。,第八章微生物的遗传变异和育种,（二）基因突变的特点,.不对应性指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。因这一突变有的可自发或其他诱变因子诱发获得。 .自发性 变量实验: 1943年S.E. Luria 等又称波动实验 涂布实验: 1949 Newcombe设计 平板培养法。 平板影印实验: 1952证明微生物的抗药性在未接触 药物前就产生了，这一突变与药物毫无关系：产生28 个突变株。 .稀有性 一般在10-6-10-9 .诱变性 可提高10 -10 5 .稳定性 遗传结构发生了稳定性的变化。.独立性 在某一群体中，即可发生抗青霉素，又可发生抗链霉素的突变型 .可逆性 野生型基因 突变型基因.,基因突变的机理 1.碱基的置换 碱基的置换属于一种染色体的微小损伤，也称点突变。分为转换（嘌呤换嘌呤，嘧啶换嘧啶）A-G；颠换（嘌呤换嘧啶或）A-T。 2.移码突变 指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的添加（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误。吖啶类染料，包括亚啶黄。亚啶橙（诱变机制还不清楚）。,基因突变的原因,1.背景辐射和环境因素 实质上是一些原因不详的低剂量诱变因素长期综合诱变作用的结果。辐射或高温。 2.微生物自身有害代谢物的诱变效应，如自己产生过氧化氢的作用。 3.互变异构效应酮式至烯醇式的互变效应引起。5-BU。,二. 突变与育种,1. 自发突变与育种 . 从生产中选育 .定向培育优良品种用某一特定因素长期处理某些微生物的群体，同时不断的对他们进行移种传代，选择相应的自发突变菌株。传统的方法。卡介苗（结核分支杆菌）的培育，法国科学家A.Calmette 和C.Guerin把牛型结核分支杆菌接种了230代，前后13年，获得了显著减毒的卡介苗。 2. 诱变育种 . 基本环节可以概括为由少数到高效,. 诱变育种应考虑的原则：,（1）选择简便有效的诱变剂： 化学诱变剂种类很多，N-甲基- N硝基-N-亚硝基胍（NTG），诱变效果显著。 NTG处理许多菌种，可得到1280%的营养缺陷型，又称为超诱变剂，而一般的诱变剂处理只得到几%，拟辐射（有些烷化剂既能诱发点突变，又能诱发只有辐射才能诱发的染色体畸变）。任何能改变核酸结构的因素都可能引起核酸生物学功能的改变。三致 “致变(正负) 致畸 致癌”,1、平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂； 2、有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高； 3、在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。 该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致 癌物时间3天，准确率85%。,化学诱变方法（较为简单的一种）： 先在平板表面涂一层出发菌株细胞，然后在平板上放几棵很小的诱变颗粒，或含诱变剂的滤纸片，在菌圈的边缘挑取突变菌落，分别制成悬乳液，稀释涂抹接种，最后用影印培养法或逐个检出法选出突变株。 物理诱变剂： 紫外线、其它射线。 常用的物理诱变方法： 紫外线诱变15w灯，30厘米，时间不短于15秒，不长于10-20分，将5毫升单细胞悬液，放置在6厘米的培养皿中在无盖条件下照射。,. 诱变育种应考虑的原则： （2）挑选优良的出发菌株 最好是经过选育过的自发变异株。 （3）处理单孢子（或单细胞）、均匀悬液 尽管如此还会出现不纯的菌落，称为表型延迟。因为诱变剂只作用于DNA一条连，故某一突变无法反映在当代表型上，对霉菌放线菌处理孢子，对芽孢杆菌处理芽孢。 （4）选用最适剂量 目前采用杀菌率为7075%，甚至3070% （5）充分利用复合处理的协同效应 同一诱变剂的重复使用、两种混合或多种先后使用、同时使用等 （6）利用和创造形态、生理和产量间的相关指标 一般分为初筛和复筛两种方案。,3. 营养缺陷型突变菌株的筛选,.培养基的选择 基本培养基（MM）仅能满足某微生物野生型营养菌株生长的 最低组分培养。 完全培养基（CM）凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的 天然或半合成培养基，称为完全培养基。 补充培养基（SM）凡只能满足相应营养缺陷型菌株营养需要 的组合培养基，称为补充培养基。, 筛选方案： 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：,第三节 基因重组,概念凡把两个不同性状个体内的基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。 注意：重组是分子水平上的，杂交是细胞水平上的概念。杂交包含重组，重组不局限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交，准性杂交等及原核生物中的转化、转导结合等都是基因重组在细胞上的反映。,返回目录,一.原核微生物的基因重组,1. 转化 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换把它整合在自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子。这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新遗传性状的现象称为转化或转化作用。,感受态受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。,2转导,转导通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获的前者部分的遗传性状的现象。获得新遗传性状的受体细胞为转导子。 普遍转导由温和噬菌体携带供体菌基因组中的任何一部分染色体片段，当他去感染受体菌时，使后者获得了这部分遗传性状的现象。,二.真核微生物的基因重组,1.有性杂交指性细胞间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。凡能产生有性孢子的酵母或霉菌原则上都可应用由于高等动植物杂交育种的方式进行育种。 2.准性杂交是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生组重子。,准性杂交主要过程为： 主要过程： 菌丝连接：它发生在形态上没有区别，但在遗传性上有差别的同一菌种的两个不同菌株的体细胞间，频率很低。 形成异核体：两个体细胞经联合后，使原来的两个单倍体核集中到同一细胞中，形成异核体，异核体能独立生活。 核融合：在异核体中的双核，偶然可以发生核融合，产生双倍体杂合子。10-5-10-7。,第四节 基因工程,概念：基因水平上的遗传工程。既用人为的方法将所需要的某一 供体生物的遗传物质DNA提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割，把他与作为载体的DNA分子连接起来，染后与载体一起导入某一更易生长的受体细胞中，让外源DNA在其中安家落户，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 1.基因工程的基本操作 2.基因工程的应用和发展前景 生产多肽类药物、疫苗中的应用：改造传统工业发酵菌种；动植物特性的基因工程改良：基因工程在环境保护中的应用。,返回目录,