第六章 微生物菌种的选育,江南大学生物工程学院,第一节 从自然界中分离筛选菌种,1、生产菌株来源 索取或购买 自己选育 用原有菌株进行遗传改造进行育种 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选 从自然界中分离菌种 从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。,设计方案采样增殖培养*平板分离 筛选(初筛、复筛)单株纯种分离 性能考察(生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）,从自然界中分离筛选菌种的一般步骤,一、采样 从自然界种采集含目的菌的样品 1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响 营养环境 水分 温度 通风 酸碱度,2 .采样方法 （1） 去除表层土 （2） 取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中 3. 注意 记录：时间，地点，环境情况等 样品袋应封好口，防止水分失去 土样应在分离前破碎 尽快分离,二. 增殖培养（富集培养）,适用：样品中目的菌数量不够多时 目的：提高样品中目的菌的数量和比例 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制,1、增殖培养的 方法 控制营养成分 控制培养基pH 控制培养温度 热处理增殖芽孢细菌 添加抑制剂,三. 纯种分离,目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养 1. 纯种分离的一般方法 （1）稀释平板法 倾注平板或涂布平板 （2）划线法 （3）组织分离法* 适用于分离高等真菌及植物病原菌,稀释分离涂布平板,稀释分离倾注平板,2、平皿反应快速检出法定性或半定量 纸片培养显色法 透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑制圈,琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序,3、厌氧性微生物的分离法 （1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh （2）创造无氧环境 物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐 化学除氧 H2 + O2 H2O (钯作催化剂） GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 （3）厌氧分离（培养）技术 高层琼脂柱技术 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术,GasPak,厌氧手套箱,厌氧培养装置,四 、筛选 初筛、复筛：,好氧培养,五、培养工艺条件试验与生产试验 1、摇瓶发酵条件 培养基组成、初始pH、通风量（装液量）、接种量、培养温度 2、小型台式发酵罐发酵工艺条件 溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂,第二节 基因突变,突变（Mutation）定义：遗传物质核酸（DNA或病毒中的RNA）的分子结构或数量突然发生了可遗传的变化。 突变是一种遗传的状态，是基因由于结构发生改变从而由原来的存在状态变为另一种存在状态，即它的等位基因。 突变体：带有突变基因的细胞或个体 突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相对的原存在状态称为野生型。,一、 突变类型,按变化范围分突变类型 (一)染色体畸变（chromosome aberration)染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。 1、染色体数目的变化 整倍体(euploidy)：含有完整的染色体组 单倍体：haploid 二倍体：diploid 三倍体：triploid 四倍体：tetraploid,非整倍体 aneuploidy：含有不完整状态的染色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员的增加或减少。 单体（二倍减一，monosomic diploid): 2n-1 缺体（二倍减二，nullisomic dilpoid): 2n-2 三体（二倍加一，trisomic diploid): 2n+1 四体（二倍加二，tetrasomic diploid): 2n+2 双二倍加一（double trisomic）: 2n+1+ 1 部分二倍体（merodiploid）：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一个染色体片段所构成的不完整二倍体。,2、染色体结构的变化,缺失 deletion： 重复 duplication ： 倒位 inversion： 易位 translocation ：,b f,(二) 基因突变（gene mutation） -染色体局部座位内的变化,点突变：只涉及DNA分子中一对或少数几对碱基的改变。突变发生在一个基因范围内。 多位点突变：突变超出一个基因范围。 1、碱基置换 base replacement DNA链上的某一碱基对为另一碱基对所取代。 转换 transition ： 颠换 transversion：,(3) 遗传学效应 错义突变 missense mutation： 同义突变 silent mutation： 无义突变 nonsense mutation：,2、移码突变 frameshift mutation：由于一对或少数几对（不是三的倍数）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遗传密码子的阅读框发生移位错误的突变。,Phe Asp Glu Pro Leu Cys Thr 5-TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG-3 GA mutation Phe Asp Lys Pro Leu Cys Thr 5-TTC GAT AAG CCC TTG TGC ACG-3 CT mutation Phe Asp Lys Pro Leu Cys Thr 5-TTC GAT AAG CCT TTG TGC ACG-3 CA mutation Phe Asp Lys Pro Leu Stop Thr 5-TTC GAT AAG CCC TTG TGA ACG-3,Phe Asp Glu Pro Leu Cys Thr 5-TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG-3 Insertion of A Phe Asp Lys Thr Leu Val His 5-TTC GAT AAG ACC CTT GTG CAC G-3,二、按表型效应分突变类型,野生型 wild type：表现该物种正常表型的生物。 突变型 mutant：由于突变导致其正常的表型发生了改变的生物。 形态突变型 生化突变型 营养缺陷型 auxotrophic mutant 抗性突变型 resistant mutant 3. 致死突变型 4. 条件致死突变型 5. 调节突变型,三、基因突变的规律,不对应性或自发性、 随机性 、 稀有性、 独立性、 稳定性、 可逆性、 诱变性 、,1、自发突变的证实 随机性、不对应性,1）波动实验 2）涂布实验 3）影印培养实验,波动实验,E.coli B 抗噬菌体a的波动测验结果,四、突变的频率： 突变率（mutation rate）：每个细胞每一世代中发生突变的概率。 世代总数=N2-N1 突变率的测定： 固体平板法测突变率：m=(M2-M1)/(N2-N1) 液体培养法测突变率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1) 液体稀释法测突变率：P0=e-mN 细胞分裂非同步性效正：突变率=ln2m=0.69m,五、自发突变的机制,环境因素的影响 微生物自身产生的代谢物的影响 转座子所造成的插入突变 DNA复制过程中偶尔发生错误,六、诱变剂及其诱变机制,诱变是指通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物而引起的突变。,(一) 物理诱变剂,1）辐射：uv，x-射线-射线等 效应：点突变或染色体畸变 机制：直接作用和间接作用 间接作用：辐射作用于染色体外物质，产 生 具有诱变作用的物质； 直接作用：辐射直接作用于染色体， 2）热：机理复杂 离子束: 能量传递、动量交换，离子沉积与电荷积累过程,1、紫外线 UV,有效波长 2650，紫外灯波长 2537 作用机理 嘧啶二聚体、嘧啶水合物、交联作用、DNA链断裂 效应： 移码突变，碱基置换,紫外线诱发胸苷二聚体,2、电离辐射：x-射线，g-射线 作用机理 直接作用：打断化学键 间接作用：通过自由基打断化学键 效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变 3、热 作用机理：脱嘌呤 效应：碱基置换，移码突变 4、离子束,(二) 化学诱变剂,碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基参入到DNA分子中的一类化合物。 主要诱变剂：5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤； 可诱发AT GC的转换。,碱基类似物 base analog 5-溴尿嘧啶(5-BU，BU), 5-氟尿嘧啶(5-FU，FU), 5-氨基尿嘧啶(5-AU，AU), 2-氨基嘌呤(2-AP，AP) 8-氮鸟嘌呤（8-NG，NG） 例：BU 烯醇式：BUe，高频出现，BUe G 酮式： BUk，低频出现， BUk=A,5-BU掺入后的掺入错误,G CA=T,5-BU复制错误,A: T G C,2. 移码诱变剂,嵌入DNA 分子相邻碱基对之间，从而有利于核苷酸的环出，因此可提高移码突变的突变率。 主要诱变剂：吖啶类化合物；溴化乙锭(ethidium bromide)，ICR系列化合物等,部分移码诱变剂,DNA 插入剂,3.化学修饰碱基的诱变剂,1）烷化剂：使DNA分子的碱基发生烷化反应，从而更容易发生错配，是最常用的一类诱变剂。 常用的有：硫酸二乙酯(DES)，甲基磺酸乙酯(EMS)，亚硝基乙基尿(NEU), 亚硝基胍(NTG), 乙烯亚胺(EI)等。 NTG（亚硝基胍）诱变作用特强，作用于复制叉，可诱发多基因并发突变，被称为超诱变剂。,Chemical reactivity of bases is responsible for some DNA lesion,Alkylated bases,部分烷化剂和烷化碱基,alkylating agents,DNA的脱嘌呤,烷化鸟嘌呤的碱基配对,烷化鸟嘌呤的交联作用,如甲基黄酸乙脂（EMS） 使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的O-6-E-G和 O-4-E-T分别和T、G配对，导致GC对转换成AT对；TA对转换成CG,2) 亚硝酸（introus acid, NA）有氧化脱氨作用，可使G第2个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌呤（xanthine,x），次黄嘌呤 (H) 仍和C配对，故不产生转换突变。但C和A脱氨后分别产生U和次黄嘌呤H，产生了转换，使CG转换成AT，AT转换成GC,3) 羟胺（NH2OH）只特异地和胞嘧啶起反应，在第4个C原子上加-OH，产生4-OH-C，此产 物可以和A 配对，使CG转换成TA 作用：与C反应，造成GCAT转换,七、DNA损伤的修复,1、光复活作用 photoreactivation,2、切补修复 excision repair（暗复活）,第三节 诱变育种,一、诱变育种的一般步骤,出发菌株 纯化、活化、同步培养 培养液 离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤） 单细胞或单孢子悬液 活菌计数，诱变预备试验 诱变处理 活细胞计数，致死率计算 中间培养(后培养) 平板分离 变异率计算 初筛复筛 保藏及扩大试验,（一） 出发菌株的选择,1. 出发菌株的类型 2. 对诱变剂的敏感性 具有特定生产性状的可能性： 要尽量选择单倍体，单核细胞（孢子),（二）菌悬液的制备,细胞的生长状态 2. 菌悬液的均一性： 3. 菌悬液细胞浓度 酵母、霉菌孢子：106107个/ml 细菌、放线菌孢子：108个/ml 4. 菌悬液介质：,（三）诱变处理,1.诱变剂的选择 对于低产或野生菌，uv线往往是首选，烷化剂等也是常用的诱变剂；对于经多次诱变处理的菌株，常需要强辐射进行处理。 碱基置换易回复，染色体畸变、移码等不易回复 细胞的透性和生理状态 经常变换诱变剂或复合处理,2.剂量选择 最适剂量因诱变