第十七章 PCR基因扩增仪 (PCR Gene Amplifier),内容提要,PCR基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理 PCR扩增仪的分类与结构 定性PCR扩增仪 实时荧光定量PCR扩增仪,内容提要,3. PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 PCR扩增仪的性能指标 PCR扩增仪的操作规程 PCR扩增仪常见故障的排除 PCR扩增仪的应用,教学基本要求,1.掌握PCR基因扩增仪的工作原理和主要性能指标。 2.掌握梯度PCR仪和原位PCR仪的功能和特点。 3.掌握实时荧光定量PCR扩增仪的种类；金属板式实时定量PCR仪和离心式实时定量PCR仪的特点。 4. 熟悉PCR技术的原理；PCR扩增仪的种类；荧光实时定量PCR（RQ-PCR）技术原理。 5.了解PCR扩增仪的操作规程；PCR扩增仪常见故障的排除；PCR扩增仪的应用。,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,一、PCR技术的发展及原理 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性退火引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,PCR的基本原理,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,二、PCR基因扩增仪的工作原理 从PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,金属板式实时定量PCR仪 可作为普通PCR仪使用 可带梯度功能 可容纳的样本量大，无需特殊耗材 温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,ABI 7500荧光定量PCR仪,MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪,Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,离心式实时定量PCR仪 温度均一性较好 使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差 可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪,Light CycleTM荧光定量PCR仪,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,Light CycleTM荧光定量PCR仪结构示意图,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,各孔独立控温的定量PCR仪 不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测。 SmartCycler的软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运用，还可实现任意梯度反应。 SmartCycler上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,SmartCycler荧光定量PCR仪,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,一、PCR扩增仪的性能指标,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,（二）荧光检测系统,激发光源,检测器,发光二极管,卤钨灯光源,超低温CCD,光电倍增管,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,（三）软件 简便的人性化设计最能满足其需求。新型的PCR仪很注重程序编写的简易性，易学易用，还具有实时信息显示、记忆存储多个程序、自动倒记时、自动断电保护等功能，很多还可以免费升级。,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,（四）其他 多样化样品基座设计、热盖等都使PCR仪越来越人性化。,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,二、PCR扩增仪的操作规程 普通PCR扩增仪的操作非常简便，接通电源，仪器自检，设置温度程序或调出储存的程序运行即可。 定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。 三、PCR扩增仪常见故障的排除,第四节 PCR扩增仪的应用,一、感染性疾病的分子诊断和研究 二、遗传性疾病的分子诊断和研究 三、恶性肿瘤的分子诊断和研究 四、PCR扩增仪在移植配型上的应用 五、PCR扩增仪在法医学上的应用 六、PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用,谢 谢！,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。 样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。 体积大，自动化程度不高，需人为干预，更换水浴锅时控温不稳定。,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一台机器便可完成整个PCR流程。 压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting现象严重。 升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度到达了设定温度，但半导体、金属块上积蓄的能量仍然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温度，即overshooting。,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,由半导体自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。 仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺，各孔扩增效率可能不一致，并且仍存在温度overshooting现象。,第一节 PCR基因扩增仪的工作原理,由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介，温度均一性好，各孔扩增效率高度一致 满足荧光定量PCR的高要求，直接发展为离心式的定量PCR仪。,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,普通定性PCR扩增仪 水浴式PCR仪：由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。 变温金属块式PCR仪：中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。 变温气流式PCR仪：由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,梯度PCR仪 由普通PCR仪衍生出的带梯度PCR功能的基因扩增仪。 每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置， 根据结果，一步就可以摸索出最适反应条件。 使用梯度PCR仪，多次实验可在一台仪器上完成，既节省实验时间，提高实验效率，又节约实验成本。,第二节 PCR扩增仪的分类与结构,原位PCR仪 由普通PCR仪衍生出的带原位扩增功能的基因扩增仪。 其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。 配有支持原位PCR模块的PCR仪可以一机两用，比较经济。,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,温度的准确性： 指样品孔温度与设定温度的一致性。 对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,温度的均一性： 指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。 “位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,升降温的速度： 升降温速度快，可以提高工作效率，提高PCR反应特异性。 样品管与基座接触的紧密性、基座的导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。,第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除,不同模式下的相同温度特性： 带梯度功能的PCR仪，应考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。 现有专利技术，能以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度。,