,DNA的复制和修复,第34章,*,It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.,一、DNA的复制,（一）DNA的半保留复制,DNA半保留复制的实验证据,1958 年Meselson和 Stahl的实验,（二）DNA复制的起点和方式,型复制,D环复制,滚环复制,真核rDNA的扩增，F因子DNA的转移，裂解途经的复制，X174，M13，G4等单链环状DNA噬菌体 第二阶段复制都是滚环复制。,线粒体DNA为D环复制,1956年 Kornberg发现的DNA聚合酶I（100kg大肠杆菌可以分离0.5g纯化的酶）由一条肽链组成，有53聚合酶活力， 53外切酶活力，和3 5外切酶活力。用蛋白酶水解得到的Klenow片段有3 5外切酶活力和5 3聚合酶活力。,（三）DNA聚合反应有关的酶,DNA聚合酶催化的反应,Protease cleavage,DNA polymerase I has three enzymatic activities in a single polypeptide chain, which can be cleaved into two functional parts by mild protease treatment.,图示为 Klenow片段与DNA的结合，模板链(12nt)为蓝色，引物链(14nt)为红色。,DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA的相互作用,DNA聚合酶I的53外切酶可以从单链切口的5 末端切除核苷酸， 5 3 聚合酶可以用脱氧核苷酸填补缺口。,DNA聚合酶I的校对作用,DNA聚合酶 的结构,DNA聚合酶的亚基二聚体与DNA结合的空间关系 (顶部观)。,DNA聚合酶的亚基二聚体与DNA结合的空间关系(立体图)。,DNA聚合酶有不少于7个亚基，可能参与DNA的修复，1999年发现的DNA聚合酶和可以复制有较多损伤的DNA。,DNA连接酶的作用机制,细菌的DNA连接酶以NAD为能源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP为能源。T4的DNA连接酶可以连接平末端。,（四）DNA的半不连续复制,从寻找失踪的酶到同位素脉冲标记发现冈崎片断,（五）DNA复制的拓扑性质,拓扑异构酶可以消除负超螺旋，对正超螺旋无作用。 拓扑异构酶可以在消耗ATP的条件下连续的引入负超螺旋，在无ATP消耗的条件下，可以松弛负超螺旋。 真核生物的拓扑异构酶可以消除负超螺旋，也可以消除正超螺旋。 真核生物的拓扑异构酶（分为和两种）可以消除负超螺旋和正超螺旋，但不能引入负超螺旋。 拓扑异构酶主要和转录有关。 拓扑异构酶主要与复制有关。 拓扑异构酶引入负超螺旋可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 双螺旋的解开需要解螺旋酶参与。DnaB是一种解螺旋酶，沿模板链的5 3 方向移动，由ATP供能，可能参与复制。解螺旋酶、和沿模板链的5 3方向移动，rep蛋白沿3 5方向移动，这几种解螺旋酶可能与修复作用有关。 SSB可以稳定单链，与单链的结合有协同效应。,复制的起始,（六）DNA复制的过程,大肠杆菌DNA复制的步骤,大肠杆菌DNA复制时冈崎片段的合成步骤,复制的延伸,复制的终止,（七）真核生物DNA的复制 DNA replication in eukaryotic cells use essentially the same principles but being more complex in the details. The best understood eukaryotic replication system is that of SV40 and yeast. Formation of the RNA primers and the initial incorporation of deoxynucleotides are believed to be catalyzed by DNA polymerase (which has no proofreading activity). Later chain extension is believed to be catalyzed by DNA polymerase , which has proofreading activity and is clamped onto the DNA templates via the PCNA trimer rings.,Specific sequences (150 bp) that can function as replication origins have only been identified in yeast ( is called autonomously replicating sequences, or ARS) and SV40 virus. The rate of DNA synthesis in eukaryotic cells is about one tenth of that of the E.coli cells. Replication in the eukaryotic genomes begin at many replication origins. 9 purified proteins are needed to replicate SV40 virus DNA in vitro. T antigen：a multifunctional site-specific DNA binding protein encoded by SV40 DNA, binds to the origin (as DnaA) and melts the duplex DNA (as DnaB);,RPA： encoded by the host mammalian cells and binds to the melted single-stranded DNA (as SSB). Pol /primase： synthesizes the RNA primers and a stretch of DNA sequences, has no proofreading activity. Pol replaces Pol /primase to further extend the RNA-DNA strand, has proofreading activity. PCNA (proliferating cell nuclear antigen)： a trimeric ring-shaped protein that clamps Pol onto the DNA template. RFC (replication factor C)： a clamp loader for PCNA. Topoisomerases： Relieves the torsional strain induced by the growing replication fork. Ligases：joins the Okazaki fragments (which is much shorter than those in E.coli cells), as well as the leading strand.,几种真核细胞的DNA聚合酶的性质如表中所示，体外或者是体内的实验均证明， DNA聚合酶和可以被抑制剂23-双脱氧胸苷和蚜肠霉素抑制，这些结果可以说明它们是DNA的复制酶。,DNA聚合酶主要是用来起始链的合成，而DNA聚合酶则是用来延伸新生成的链的。另外两种DNA聚合酶和，则主要是用来参与修复反应的。而DNA聚合酶则是负责线粒体DNA的复制的。,E.coli SV40/人 酵母 功能 DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白 DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶 DnaC P ? Cdc6 装配因子 DnaG DnaG Pol-引发酶 Pol-引发酶 引发酶 Pol的 亚基 Pol Pol,Pol 聚合酶 Pol的亚基 Pol Pol,Pol 校正 Pol的亚基 PCNA(增殖核抗原) PCNA 滑动钳 复合体 RF-C RF-C 滑动钳装配器 SSB RF-A RF-A 单链结合蛋白,原核和真核生物复制体系的比较,Model of in vitro replication of SV40 DNA by eukaryotic enzymes: 1. T antigen (Tag) binds and unwinds replication origin; 2. RPA (or RFA) binds to single-stranded DNA; 3. Pol -primase synthesizes the primers (RNA + DNA).,4. RFC loads PCNA to the template. 5. PCNA displaces Pol-primase and functions as a DNA clamp; 6. Pol replaces Pol-primase and further extends the DNA strands.,酵母的自主复制区 多个ARS(autonomously replicationg sequence)发挥复制起点的功能。 酵母染色体的着丝粒附近为ARS1序列，ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用。A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能。B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。B3是ABF1（ARS-binding factor 1）结合区。 ORC(origin recognizing complex)：由6个亚基组成相当于DnaA和的O蛋白，与A/B1结合后结合于游离的DNA。 Cdc6:相当于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。这对于在Origin上起始复制是必须的。 Mcm: DnaB螺旋酶。即 licensing factor ABF1：（转录因子）结合于B3,酵母DNA复制的起始,起点辨认复合体,由酵母cdc6基因编码的复制激活体蛋白,小染色体维持蛋白（复制许可因子）,周期蛋白-周期蛋白依赖性蛋白激酶,由酵母cdc7,dbf4基因编码的另一种蛋白激酶,前复制复合体,后复制复合体,PCNA（增殖细胞核抗原）三聚体的结构与原核生物DNA聚合酶 的亚基二聚体相似。,真核生物DNA复制的模式,复制蛋白A,复制因子C,(a)前导链的合成由DNA聚合酶起始，然后RFC除去DNA聚合