1,免疫组化技术及 操做关键介绍,2,染色原理,免疫组化染色,Ag,Ab,报告,提高敏感性 减少非特异性,3,染色原理,免疫组化染色,一抗,二抗 +,示踪剂,显色,直接法 间接法 ABC法 LSAB SP Envision法,4,5,卵白素（avidin） ：鸡蛋白中的一种碱性蛋白，分子量为 68 kD，属于糖蛋白。 生物素（biotin），机体中的一种物质，又叫维生素H。 Avidin 和biotin 之间有很强的天然的亲和性。一个avdin分子有4个biotin的结合位点。 Biotin还可以和抗体IgG的Fc段结合，不影响IgG的活性。同时，生物素经活化后也可和过氧化物酶或ALP等结合，而不影响酶的活性。,6,(avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC),可接150个Biotin,临时混合,7,链霉亲和素（strept avidin），从链霉菌培养物中提取，比 avidin更好。 等电点接近于6.5，近中性，与被检查组织的非特异结合很少。 与Biotin形成复合物，穿透组织能力强。 用strept avidin 替代 avidin 的技术 SABC 法 SP法（Streptavidin-Peroxidase）,受内源性生物素和过氧化酶影响,8,Envision法 （标记的葡聚糖聚合物法） 最敏感的方法，不受内源性生物素影响,葡聚糖聚合物,EnVision系统是将二抗和酶联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，再与已经结合的一抗反应，最后显色剂显色。,9,一抗：鼠抗、兔抗 二抗：抗鼠、抗兔、兔鼠同抗 示踪剂：金属、荧光素、酶（辣根过氧化物酶HRP常用）,抗体及示踪剂介绍,10,组织处理 染色 读片,冰冻切片 石蜡包埋、切片 固定、脱水、包埋 切片,染色前的处理 染色 封片,技术流程,11,载玻片用多聚赖氨酸或APES防脱片处理 5um连续切片，室温保存，使用前 60烤1小时,12,13,染色前处理 脱蜡到水 抗原修复（Antigen retrieval）-暴露抗原 0.01M、pH6.0 柠檬酸缓冲液 微波炉、高压锅、高压灭菌锅、电炉 微波炉法 缓冲液倒进烧杯，加热煮沸 放入切片（耐高温塑料架），继续煮 10分钟（定时） 切断电源，烧杯放在流水中冷却 缓冲液倒掉，倒入蒸馏水洗两次,14,切片放在金属架上(不宜太密) *高压锅加入0,01M 枸橼酸钠缓冲液3L, 煮沸 *金属架放在枸橼酸钠缓冲液内, 加盖, 加压1-5 *自来水浴冷却高压锅 *自来水洗-Tris buffer,抗原修复 高压,15,抗原修复是免疫组化发展史上的一个里程碑 甲醛固定造成蛋白之间交联，加热打断交联物暴露抗原，达到修复的目的。 现在，抗原修复已应用到流式细胞术、原位杂交、免疫电镜等过程中。,石善溶 抗原修复技术研究进展 中华病理学杂志 2007，36（1）：7,16,蛋白酶消化 * 0.1% 胃蛋白酶 30 * 0.01-0.1% 胰蛋白酶 15-2小时 * 0.0025% 链酶蛋白酶 4-6,抗原修复 酶法,17,染色前处理 脱蜡到水 抗原修复 内源性过氧化物酶阻断（简称阻断）,18,内源性HRP和BIOTIN,内源性HRP分布: 脑, 脾, 中性WBC, 巨噬细胞 血红蛋白和肌红蛋白含有铁卟 啉具有内源性HRP活性,内源性HRP消除 3% H2O2, 5 常用 0.3% H2O2甲醇溶液, 15 常用 0.1% HCl 酒精溶液, 30 0.2% 醋酸甲醇溶液, 30 0.01% 过碘酸 5-10, 0.1% 硼酸钠 10,19,染色前处理 脱蜡到水 抗原修复 内源性过氧化物酶阻断（简称阻断） 内源性生物素封闭（简称封闭）,内源性生物素,20,（1）冰冻组织中存在内源性生物素。 （2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。 （3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。 （4）内源性生物素暴露的强度各不相同。 （5）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布 也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。 （6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺 上皮组织，亦存在部分非上皮组织。 （7）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。 （8）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增 加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA。 （9）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。,21,1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。 可采用蛋清或卵白素作为封闭剂。 2、或采用非生物素检测系统，如EnVision等。 3、应坚持使用阴性对照。,内源性biaotin去除,22,染色前处理 脱蜡到水 抗原修复 内源性过氧化物酶阻断（简称阻断） 内源性生物素封闭（简称封闭） 设置对照,阴性对照：缓冲液、免疫前血清、 吸收试验 明确没有被测抗原的组织 阳性对照：明确有被测抗原的组织 如转染某种质粒的细胞和没转染的细胞,23,染色-分步向组织片上滴加抗体 一抗、二抗、复合物 显色,Streptavidin,Enzyme,biotin,脊状分子,无生物素,24,一抗：鼠抗、兔抗 即用型、浓缩型、自制抗体 选择适当的稀释度（浓缩型、自制抗体） 一定要找到两个端点 稀释度恰当的标准： 最好的阳性显色和最低的背景,25,二抗及以后的试剂为试剂盒，浓度不要调整。但要决定用什么厂家、品牌的试剂盒。 试剂盒 抗兔、抗鼠、抗兔/鼠 什么工作原理 SABC、SP、 Envision 厂家：迈新（福州）、Dako等,26,时间和温度： 一抗 4过夜或室温1小时 其它 室温10-30分钟,注意点：用湿盒、组织不能干、 抗体覆盖组织、50ul/张 试剂4保存、PBS或TBS,显色 显色剂,27,辣根过氧化物酶,horseradish peroxidase，HRP,酶,DABAEC,底物,HRP的优点有以下几个方面 (1)体积小(分子质量40kDa)，不会遮盖抗原的结合部位，且穿透力强。 (3)具有较高活性及特异性。 (4)不溶性好，终产物不向周边扩散。 (5)组织中内源性酶较少，抑制方法较多。,催化过氧化氢分解而使其他氢供体氧化并生成水的一类酶。以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。,28,3，3二氨基联苯胺(DAB)为棕褐色 3氨基9乙基卡巴唑(AEC)为红色 4氯1苯酚(CN)为蓝色 DAB是广泛应用的电子供体，产物既不溶于水，又不溶于有机溶液，可长期保存。其终产物具有嗜锇性，经锇酸处理后电子密度增加，适用于电镜下观察。但DAB的缺点是具有潜在的致癌性，所以应尽量减少吸人和接触次数，并严格管理废液。 AEC室温下较稳定，产物不溶于水，但溶于有机溶剂，所以不能进行脱水等处理；又因其需用水溶性封固剂，时间长易褪色，限制了其应用。,29,显色的酶 底物 显示颜色 封片 辣根过氧化物酶 H2O2/DAB 棕色 中性树胶 H2O2/AEC 红色 甘油 碱性磷酸酶 NBT/BCIP 深蓝色 甘油,30,碱性磷酸酶Alkalinephos phatase AKP 分子100kDa，穿透细胞组织的能力较弱。某些组织细胞内含有较高的内源性碱性磷酸酶， 对IHC染色会产生一定的干扰 。 AKP主要用于血涂片或骨髓涂片的白细胞相关检测。 AKP的呈色反应的敏感性要比HRP高23倍，显色时间可从30min到48h，可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记。另外，内源性碱性磷酸酶可以在底物缓冲液中加入左旋咪唑(1evamisole)和镁离子(氯化镁)，或提高底物缓冲液的pH值，可以有效地消除内源性碱性磷酸酶。目前该酶已广泛应用于原位杂交检测的显色和双重酶标染色。,31,显色 显色剂 DAB 棕黄色 时间 显微镜下控制 3分钟左右，不能太快,32,复染：苏木素（精），核染蓝色,封片：中性树胶或甘油,DAB,AEC,33,读片,阴性对照 PBS（） 阴性组织（） 阳性对照 定位：胞浆、胞核、胞膜、胞膜/胞浆 细胞类型：淋巴细胞、癌细胞、 血管内皮细胞、平滑肌细胞 结合HE染色切片分析,34,35,这里不是癌组织，是否为非特异性染色？不能将棕色的地方就认为是阳性。,36,上图高倍放大,37,与上同一切片的粘膜层，没有着色,38,与上同一切片，此处的粘膜层有着色，但是不是阳性，需进一步分析。,39,半定量：根据阳性强度和分布 5%或10%以下为阴性 11%-25%（+）、26%-50% （+） 51%-75% （+）、75%（+） 数字化定量：光密度测定（OD值） 与某些生物学特性的相关性分析 生长增殖、分化、转移、复发、疗效 统计学处理 注意：读片的过程非常重要、要反复多看、 寻找规律、提炼精华,IHC为定性结果：阳性,40,41,谢 谢！,