分 子 生 物 学 检 查,南京中医药大学西内教研室 徐庆,分子生物学定义,分子生物学（molecular biology)是从分子水平研究生命现象的科学。它的核心内容是通过生物的物质基础核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用等运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探索生命奥秘,分子生物学发展简史,1871年 Miesscher 首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA 1953年 Watson和rick 阐明DNA双螺旋结构 1958年 Meselson 和Stahl 提出DNA半保留复制模型 1965年 发现质粒 1966年 Nirenberg 等破译全部遗传密码 1970年 Smith分离到第一种核酸内切限制酶 1973年 Boyer和Cohen 建立DNA重组技术 1977年Sanger以及Maxam 和Gilbert 发明快速DNA测序技术 1981年 Palmiter和Brinster成功获得第一只基因小鼠 1985年 PCR方法问世；Watson出任“人类基因组计划”首席科学家 1990年 美国批准第一个体细胞基因治疗方案,分子生物学发展简史,1995年 英国“自然”杂志发表人类基因组全物理图 1997年 英国爱丁堡罗斯林研究所培养出第一只克隆羊多莉 1999年 中国正式加入“人类基因组计划（HGP）” 2000年 全部人类基因组测序工作宣告完成，进入 后基因组计划时代( 基因克隆计划、基因组多样性计划、 cDNA计划、蛋白质计划、细胞计划）,分子生物学与现代医学,一、 分子生物学在发病机制中的应用 1 阿尔兹海默病（AD）的基因定位 2 生物活性多肽及蛋白质mRNA研究 确证肾素血管紧张素系统在遗传性高血压发病中起重要作用 3 对某些病毒致病作用的研究 发现肝癌细胞DNA整合有HBV-DNA，认为乙肝与肝癌发病密切相关 4 认识了某些遗传疾病的发病机制 地中海贫血是或基因缺失或点突变所致,二、分子生物学在疾病诊断中的作用,发病过程： 基因突变-mRNA-蛋白质（激素）-细胞病变-组织器官病变-临床症状 根据基因突变检测、基因连续性分析、mRNA检测三种途径，使用核酸分子杂交和PCR技术，进行分子生物学检查，使遗传性疾病、感染性疾病和肿瘤等的诊断提前到基因和mRNA水平,三、分子生物学在疾病治疗中的应用 基因治疗： 将目的基因加以修饰，转移到体细胞中，以达到治疗作用 应用： 单基因遗传病、肿瘤、心血管、自身免疫疾病及病毒感染等危害较大且目前无有效治疗途径的疾病 四、重组DNA技术与新药研究 重组微生物、基因疫苗、细胞因子合成、转基因动植物等,分子生物学的一般原理和研究方法,一、核酸的结构和功能,1 核酸的一级结构：磷酸二酯键连接成的核苷酸链 核苷酸：戊糖、磷酸基团、碱基 碱基： DNA：A、 G 、 T 、 C RNA：A、 G 、 U、C 核酸是极性分子，5端为磷酸基团，3端为羟基，核酸序列的习惯写法是 5端 3端,核酸的结构和功能,2 DNA的二级结构：著名的双螺旋结构 两条核苷酸链通过碱基间氢键相连（AT， CG），走向相反。 DNA的变性与复性： 诱导因素：加热、酸、碱、 乙醇、丙酮、高盐等 应用：分子杂交的基础,核酸的结构和功能,3 DNA的三级结构：DNA双螺旋和核小体 串珠装状的核小体压缩成螺旋形，进一步折叠成染色单体，DNA长度因此缩短10000倍 4 DNA功能 携带和传递遗传信息，体现遗传过程的相对保守性 遗传的中心法则 DNA RNA 蛋白质,复制,转录,逆转录,复制（病毒）,翻译,核酸的结构和功能,5 DNA的 半保留复制原则,核酸的结构和功能,6 RNA： rRNA ：组成核糖体 mRNA ：传递遗传信息由核内至胞浆的核糖体 tRNA：转运氨基酸 密码子：共64个密码子，有61个用于编码20个氨基酸，另外还有3个作为终止密码(UAA、UAG、UGA),二、基因及其表达调控,基因：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列。一个基因不仅包括编码序列，还包括所需的调控序列、5端不翻译序列、内含子和3非翻译序列等所有核酸序列 基因组： 一个生物体的所有基因。人类指23对染色体中的所有基因,基因及其表达调控,基因表达调控： 多层次 DNA及染色体水平 转录水平 转录后水平 翻译水平 蛋白质加工水平,三、人类基因缺陷的主要类型,突变 指突变体中DNA结构的任何改变，致使基因作用（结构蛋白、酶等），以致个体表型改变 （一）点突变：单个核苷酸的置换 （1）同义突变：GAU GAC 均是天门冬氨酸 密码子 （2）错义突变：翻译出的氨基酸改变 （3）无义突变：产生提前出现的终止密码子 （4）延长突变：终止密码子突变为氨基酸密码子,人类基因缺陷的主要类型,（二）缺失或插入 小的缺失或插入，碱基数量非3的整倍数，称移码突变，若为3 的整倍数，出现密码子的插入或缺失 （三）染色体畸变 染色体结构发生大范围改变：倒位、缺失、插入、易位,四、基因工程,基因工程 是指在体外的条件下，人工将DNA分子“剪切”并重新“拼接” ，形成一个新的杂合的DNA分子，然后将它导入微生物或真核细胞内进行扩增，使该基因在细胞内高效表达，从而产生人类需要的基因产物或改造、创造新的生物类型,基因工程,基因工程的基本程序 （1）带有目的基因的 DNA片段的获得 （2）DNA片段与载体 DNA连接（体外重组） （3）连接产物导入 宿主细胞 （4）重组体的扩增、 筛选与鉴定 （5）目的基因在细胞中 的表达 （6）表达产物的分离、 鉴定等,基因工程,（一）基因工程的工具酶 限制性核酸内切酶 核酸修饰酶：连接酶、聚合酶、 核酸酶、 碱性磷酸酶等 （二）基因工程的宿主细胞和载体 原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌 宿主细胞 真核细胞：哺乳动物细胞 大肠杆菌：质粒、噬菌体衍生载体 常用载体 哺乳动物细胞：单链噬菌体载体、 逆转录病毒、腺病毒,基因工程,（三）目的基因的分离 已知基因的获得：限制性内切酶酶切法 PCR法、RT-PCR法、 人工合成DNA片段法 基因文库筛选法 未知基因的获得：蛋白质 DNA策略,基因工程,（四）目的基因与载体的连接 工具：DNA 连接酶 产物：重组体 （五）重组DNA分子导入宿主细胞 转化：导入细菌 转染：导入噬菌体、病毒 宿主菌必须是限制酶缺陷型和DNA重组缺陷型,基因工程,（六）重组体的筛选 直接筛选法：借助遗传表型进行筛选 插入失活法：pBR322质粒结合氨苄青霉素（Ap）和四环素（Tc）抗性基因，插入后失活Tc 插入表达法：pTR262质粒的四环素抗性（Tcr）基因上游cI基因，插入后cI基因失活，抗性表达 （七）克隆基因的表达,基因工程,插入失活法筛选重组体示意图,基因诊断,一、基因诊断的基本原理 运用现代分子生物学和分子遗传学方法检测基因结构及其表达功能是否正常，从而对人体状态和疾病作出诊断。基因诊断检测的靶物是DNA或mRNA,基因诊断,二、基因诊断的特点 1 高度特异性 2 高灵敏度及精确性：PCR方法克检测出pg级 水平靶基因 3 早期快速：结合杆菌培养需几周，痰涂片染色 阳性率低，PCR方法一个工作日确诊 4 被测基因不一定处于活化状态 三、基因诊断的临床意义 1 优生优育 3 预防医学 2 器官移植 4 感染性疾病,核酸分子杂交技术,定义： 依据DNA双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法,核酸分子杂交技术,一、探针的特征和种类 探针是一段与被测核苷酸序列互补的带标记的核苷酸片段 特征：1 要加以标记，带示踪物 2 单链 3 选取基因编码序列 4 高度特异性 5 长度十几到几千碱基 6 标记探针高灵敏度、稳定，标记 方法简便、安全 种类：基因组DNA探针、cDNA探针、 寡核苷酸探针、RNA探针,核酸分子杂交技术,二、探针的标记物 放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I 非放射性物质：生物素、地高辛、荧光素、酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶等）及金属Hg等 三、核酸分子杂交方法 液相杂交；固相杂交 固相载体：硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶、 磁珠等,核酸分子杂交技术,杂交基本程序,核酸分子杂交技术,几种固相核酸分子杂交方法： 1 Southern 印迹杂交法： DNA分子经酶切核琼脂糖凝胶电泳后，放入碱溶液中变性，将变性后的单链DNA从凝胶上吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上用与杂交,核酸分子杂交技术,2 Northern 印迹杂交法： 经典的RNA分析法，类似Southern印迹，主要区别是在变性剂存在下，以琼脂糖凝胶电泳分离RNA 3 斑点或狭缝杂交 4 原位杂交：核酸分子探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,核酸分子杂交技术,四、杂交信号的检测 1 放射自显影：X光片检测放射性核素标记物 2 非放射性探针检测： （1）偶联 （2）显色：酶促、荧光、化学发光,聚合酶链式反应（PCR）,1985年 Kary BM 创建了聚合酶链反应（polymerase chain reaction ,PCR)技术，又称体外基因扩增技术，该技术可扩增核酸靶序列，增加106倍，极大提高检测灵敏度 原理：利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。PCR全过程由DNA模板变性、模板与引物结合及引物延伸三个步骤组成,聚合酶链式反应（PCR）,PCR反应的原理示意图 1 DNA模板变性 2 模板与引物结合 3 引物延伸,聚合酶链式反应（PCR）,PCR条件的优化 1 模板核酸： 来源广泛、需部分纯化、去除DNA聚合酶抑制剂 一般宜用ng级的克隆DNA，g水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增模板 用于检测目的，扩增片段长度一般不超过500bp，以100-300bp为好 2 引物 应纯化，浓度不宜过高 一般终浓度为0.2-1.0 mol/L,聚合酶链式反应（PCR）,3 缓冲液 目前最常用PCR反应的缓冲液体系为10-50mmol/L Tris-HCl （PH8.3-8.8，20C） 偏碱性有利于Taq DNA聚合酶作用 缓冲液中50mmol/L KCl利于引物退火 Mg2+对产量和特异性有显著影响，过高特异性下降；过低产量减少。在各种dNTP浓度为200 mol/L时Mg2+为1.5-2.0mmol/L较合适,聚合酶链式反应（PCR）,4 dNTP 浓度 常采用50-200 mol/L的dNTP 4种dNTP浓度要一致 5 Taq DNA聚合酶用量 在100 l 总反应液中，一般所需Taq DNA聚合酶用量为0.5-5 U，通常加入2.5 U，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸速度,聚合酶链式反应（PCR）,6 循环参数 （1）变性温度与时间 94 C 30s （2）退火温度与时间 退火温度决定反应特异性 取决于引物的长度、浓度和碱基组成（G+C含量）。长度为15-25bp时，退火温度可根据Tm=4（G+C）+2（A+T） （3）延伸温度与时间 72 C 待扩增片段 1kb，1min；1kb 3-4min （4）循环次数 20-25个循环,聚合酶链式反应（PCR）,PCR扩增产物分析法 （1）凝胶电泳法 （2）点杂交分析结果 （3）微孔板夹心杂交法 （4）PCR-ELISA法,限制性片段长度多态性分析,概念： 当DNA序列差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复致使基因组DNA 经限制性内切酶水解发生片段改变。这种在同种生物不同个体间出现不同长度限制性片段类型，就是限制性片段多态性（RFLP）,限制性片段长度多态性分析,人类基因组存在两类多态性： 1 限制性内切酶酶切位点改变造成的RFLP 2 串联重复顺序拷贝数不同造成的