同学们好！,第二十五章 动物克隆技术,克隆动物(clonal animal)是指人们采用动物克隆技术得到无性繁殖的在遗传上与亲本动物完全相同的动物。,1997年世界卫生组织解释克隆为遗传上同一的机体或细胞系(株)的无性生殖。,分子水平上的克隆是指DNA分子的复制。,细胞水平上的克隆是指细胞或组织培养。,个体水平上的克隆是指动、植物的无性繁殖，其中，动物克隆偏重于指细胞核移植。,第一节 动物克隆技术的 理论基础及发展简况,动物克隆技术的理论基础是动物细胞发育的全能性。,动物细胞核都含有与生殖细胞相同的遗传信息，因此具有发育的全能性。,两方面突破：,卵母细胞的细胞质中含有启动供体核重新编程(reprogramming)的各种因子。已经分化的细胞核重新回到未分化的起点，重新编程形成重构胚并被激活。,一、细胞发育的全能性,（一）全能性的概念,全能性(totipotency) 是指分裂球发育成为完整胚胎的能力。包括细胞发育全能性和细胞核发育全能性。,1、细胞的全能性,细胞分化能力的强弱称为发育潜能。 根据发育潜能可以将细胞分成全能性、多能性、单能性细胞及终末分化细胞。 受精卵以及胚胎干细胞的发育具有全能性；多能造血干细胞具有的发育潜能称为多能性 ；终末分化细胞，如人的成熟红细胞 。 细胞全能性的基础在于所有细胞的细胞核包含一个物种的全套染色体组，具有发育成一个完整个体所需要的全部遗传物质。,2、细胞核的全能性,细胞核的全能性是指一个细胞核具有该物种完整的遗传信息，在适当条件下能够发育成一个完整个体的能力。 将分化的细胞的细胞核导入去核的卵细胞或受精卵，发育成一个完整的个体（如体细胞克隆动物），就是细胞核全能性。,（二）证明细胞全能性的研究事例,1、动物早期胚胎细胞的全能性,德国Virchow R. 论断“细胞来自细胞”。,Roux(1888) 用烧烫的针破坏蛙2细胞胚胎。,Driesch(1892)以海胆做实验。,Spemann（19011903）用细发结扎蝾螈受精卵。,Roux(1888)用烧烫的针破坏蛙2细胞胚胎观察胚胎发育情况,2、已分化的动物细胞的全能性,Spemann 蝾螈受精卵结扎实验, 两栖类的核移植实验,Spemann的蝾螈受精卵结扎实验(1938),用头发将受精卵沿第一次卵裂面结扎成2个半球，使细胞核留在其中的一个半球中，两半球之间留有一条小缝隙，当有核的一侧发育到8细胞期时，另一侧还未开始分裂；当有核的一侧发育到16细胞期时，一个细胞核进入无核的一侧，此时将胚胎完全结扎；140 d后，每一侧都发育成为一个完整的胚胎。,1952年，美国科学家Briggs和King以美洲豹蛙做核移植实验。将未分化的蛙囊胚细胞的细胞核移植到蛙去核受精卵中，获得了正常发育的蝌蚪。,后来的实验得出结论：蛙胚胎细胞核的发育潜能随着胚胎发育的进程、细胞分化的提高而逐步下降。,1962年， Gurdon通过连续核移植，将爪蟾蝌蚪已经分化的肠上皮细胞核移植到去核的卵母细胞中，获得了可育的成熟个体。,1977年，Gurdon以一只白化爪蟾蝌蚪细胞为供体，克隆到了30只白化非洲爪蟾。, 哺乳类的核移植实验,1981年，瑞士科学家Illmensee和美国科学家Hoppe首次报道哺乳动物细胞核移植获得成功。, 哺乳类的核移植实验,1983年，McGrath和Solt结合显微技术与细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎与未受精卵用病毒诱导融合的方法获得了后代 。 1996年，Campbell等采集9d龄的绵羊胚胎进行传代培养，以培养液中血清浓度递减的饥饿培养，诱导6-13代细胞进入静止期，移入去核的卵母细胞，产下了克隆羊。这是用已分化细胞系经诱导进入Go期核移植产下的首例克隆羊。, 哺乳类的核移植实验,1997年，英国 Roslin研究所的Wilmut等用乳腺细胞核移植培育克隆绵羊“多莉 (Dolly)”。Wilmut等采用6岁母羊（白面）怀孕3个月时的乳腺细胞进行核移植。供体核在血清浓度从10降至0.5的培养液中诱导至静止期，然后移入去核卵母细胞，发育为桑椹胚和囊胚再移植到受体母羊（黑面），结果产羔l头（白面） ，即著名的“多莉”。,这是世界上首次用体细胞克隆获得的后代，划时代意义在于证明动物成体细胞核仍具有发育全能性。,体细胞核移植法培育克隆绵羊一多莉,二、供体核重新编程,早期使用原核期的受精卵和2细胞胚胎。1986年后采用去核的处在M期(第二次分裂中期)的成熟卵母细胞作胞质受体。,1、受体细胞的来源,2、重构胚核质适应机理,Gurdon（1966）研究发现，核在移植前转录rRNA基因，移入卵后，核仁消失，rRNA基因失活；随着胚胎的发育，rRNA基因活性恢复，核仁重现。表明卵细胞质对核活性有重构效应。 事实上，核重编程同核质间蛋白质交换有关。许多细胞质因子，如组蛋白(去)、乙酰化酶、DNA甲基化/去甲基化酶等进入核内；核内转录因子，如异染色质蛋白、组蛋白H1等输出核外。,（1） 核质互作,（2）核重编程,核重编程的过程就是基因重新被激活的过程。 体细胞去分化过程伴随着与染色质相关的蛋白(如连接组蛋白、转录因子)的重构、基因组甲基化变化、组蛋白组装及核小体形成等。染色质解聚对核重编程可能是必须的。 核重编程涉及到基因组DNA甲基/去甲基化和组蛋白乙酰化。通过基因组甲基化来改变DNA与蛋白质间的作用。,（3）端粒,在细胞分化过程中，核重编程须去除染色质上的获得性修饰。 牛成纤维细胞核克隆胚胎的端粒酶活性比胚胎干细胞样细胞的端粒酶活性显著降低；用血清饥饿法进行细胞传代，与不经处理的早期传代细胞相比，端粒酶活性降低30%-50%。 体外培养牛胎儿成纤维细胞和胚胎干细胞样细胞晚期传代中发现了端粒缩短。,3、细胞周期,细胞周期分四个时期，包括G1期，S期，G2期，M期。有丝分裂中，成熟促进因子（也叫M期促进因子MPF ）调控细胞由间期向M期转变。 核受体一般是M期卵母细胞，但是M期卵母细胞MPF的含量依然很高，将诱导移植核发生一系列的形态变化，包括核膜破裂(NEBD)，早熟染色体凝集(PCC)。只能将G1期(二倍体)的核移入未经活化的M期的卵母细胞的细胞质，才能获得染色体倍体正常且能正常发育的重组胚胎。,供体核重新编程的机理,具有全能性的细胞核是否具有重编程的能力，主要取决于细胞质启动供体核重新编程的因子。 核重编程涉及到基因组DNA甲基/去甲基化和组蛋白乙酰化。 在细胞分化过程中，核重编程须去除染色质上的获得性修饰。与端粒酶活性降低、端粒缩短有关 。,第二节 动物克隆技术方法,动物克隆技术方法可分为胚胎分割、胚胎嵌合、细胞核移植、雌核或雄核发育等。 细胞核移植方法又分为胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植和体细胞核移植等。,一、细胞核移植克隆技术,供体细胞（核供体）的准备。 受体细胞（细胞质受体）的准备。 核移植。 核质融合及卵母细胞质的激活。 重构胚的培养和移植。 重复克隆。 克隆动物的鉴定。,其基本技术环节除显微操作技术外，主要包括 ：,体细胞克隆猪图解,细胞核移植技术进行动物克隆的主要步骤，包括供体细胞的选择、 受体细胞的去核、核移植、胚胎融合、重构胚胎移植，以及连续核移植等等。,1、供体细胞的准备,常用的供体细胞有3大类：早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞。核移植时可以将整个细胞作为供体，也可以挑取细胞核或含有少量细胞质的细胞移植到受体中,供体细胞的准备方面，通常采用建立细胞系的办法 。包括： 胚胎干细胞系的建立。 TNT4细胞系的建立。,将供体细胞的细胞周期做同步法处理，即G0期的诱导。方法是：在5d内将培养液的血清浓度由10.0%降至0.5%。,2、受体细胞的准备,受体细胞有3类：卵母细胞、原核期受精卵和2细胞期胚胎细胞。,获得卵母细胞多采用活体超排的方法。,卵母细胞的去核目前多采用显微操作法，即在显微镜下用外径为20m的微细玻璃管吸管吸取细胞核。常用的去核方法有盲吸法、半卵法和功能去核法等。,3、核移植,在显微操作仪下将供体细胞核移入受体细胞中。根据供体移入到受体细胞的不同部位，可以分为带下（透明带下）注射和细胞质内注射。,4、核质融合及卵母细胞质的激活,核质融合的方法有： (1)病毒融合法 如将仙台病毒与供体核一起注入去核的受精卵中，促进细胞融合。 (2)电融合法 将重构胚置于电场下，以电脉冲促进融合。 (3)Honolulu技术 利用吸液管将遗传物质取出，然后注入卵细胞中。以机械和化学激活方式促使重构胚的融合。,5、重构胚的培养和移植,一种是体外培养，在适当的培养条件下培养到一定时期，然后进行胚胎移植。 另一种方法是采用中间受体培养，在核质融合后，将重构胚用琼脂糖包埋，移入动物的输卵管或子宫，发育到桑椹胚或囊胚后，再重新移入假孕受体子宫。,6、重复克隆(连续核移植),如有必要，将核移植胚胎培养至桑椹胚或囊胚后继续做核供体重复克隆，可以显著提高克隆成活率。,7、克隆动物的鉴定,克隆动物出生后，从形态、性别上和分子生物学水平上鉴定，以确定所克隆的动物在遗传上是否真的来源于供体细胞系。 分子生物学鉴定方法有PCR、Southern、Northern等。,克隆绵羊多莉（Dolly）的培育示意图,二、人工诱导雌核发育技术,技术关键：一是使精子的遗传物质失活且保持精子激活卵子发育的能力；二是诱导卵子二倍体形成。 使精子遗传物质失活的办法一般是采用辐射处理(如线、X射线、紫外线等)。 诱导卵子二倍体形成的办法，一是在受精后不久抑制第二极体排出；二是在受精卵第一次卵裂时，抑制有丝分裂。可以用温度(冷休克或热休克)、静水压和化学(秋水仙素、细胞松弛素B等)等方法。,在受精过程的原核期中用显微手术操作把雄性原核吸出，再把变成单倍体的卵子用细胞松弛素B处理回复到二倍体之后，再移植到假孕动物，使之发育成胎仔。,二、人工诱导雌核发育技术,红鲫 鲤鱼 卵 子 精 子 紫外灯照射 (激活) (遗传物质灭活) (30W,45min) 单倍体胚胎冷休克(04，30min) 二倍体胚胎纯合二倍体红鲫(近交系),雌核发育二倍体红鲫的培育,三、胚胎嵌合技术,选择两对毛色不同的近交系小鼠（例如白色的SJL小鼠与黑色的BL/10小鼠）。在8分裂球时，用蛋白酶消化透明带，在37的条件下，将来自两个品系的两种分裂球彼此接触，任其粘成一个具有双倍体积的早期胚胎，继续培养成胚囊，移植到寄养母鼠的子宫内。新生小鼠表现出黑、白条或块状的毛色，说明是一只嵌合体小鼠。,嵌合体小鼠培育过程,四、胚胎分割技术,用显微术将未着床的早期胚胎一分为二、四或更多，然后分别移植给受体，妊娠产仔。 胚胎分割不是严格意义上的克隆。 胚胎分割已得到多种动物的胚胎双生后代，如兔、小鼠、绵羊、牛、山羊、马和猪的同胚双生后代。 80年代以来，牛胚胎二分割已应用于生产。 胚胎分割是胚胎移植的重要措施，也是性别鉴定和核移植等生物工程的基本技术。,第三节 动物克隆技术的应用,一、克隆技术为近交系实验动物培育 提供了新途径,克隆技术为近交系实验动物培育提供了新途径，通过这一途径培育的实验动物，遗传组成完全一致，并且比用传统的近亲繁殖方法更省时，品系更纯。,二、克隆技术为解决 异体器官移植供体带来了希望,猪的器官在大小、形状及生理特点等方面与人的器官非常相似。可以将猪作为异体器官移植的供体。 在异源移植方面，最主要的问题就是急性排斥问题。将猪细胞的细胞膜上的A-1，3-半乳糖昔酶基因敲除或经过修饰去除其免疫原性，可以解决猪器官在人体的急性排斥问题。,三、治疗性克隆技术 已成为人类医疗史上革命性的技术,治疗性克隆是指利用克隆技术结合人的胚胎干细胞分离技术，在体外培养人体细胞、组织或器官来修复人体损伤的细胞、组织或器官的过程。 将病人自身体细胞移植到去核的卵母细胞内形成重构胚，从重构胚中分离出ES细胞，并诱导其定向分化为需要替代的细胞，如分化为心肌细胞修复受损的心脏、分化为胰岛细胞治疗糖尿病、分化为多巴胺神经原治疗帕金森氏症等