实训二 细菌病的实验室诊断,实验内容,病理剖检 细菌分离培养、涂片染色镜检 培养物鉴定 涂片染色镜检 纯化培养、鉴别培养 生化试验,一、目的 掌握细菌病的实验室诊断方法。 二、器材 动物：病死鸭 器材：搪瓷盘、手术刀、手术剪、镊子、玻片、革兰氏染液、电吹风、酒精棉、酒精灯、接种环、普通琼脂、麦康凯琼脂、鲜血琼脂平板、显微镜、擦镜纸、香柏油、生化培养管,一、病理剖检 记录病理变化 二、细菌分离培养和抹片、染色、镜检 1、细菌分离培养 （1）用火焰灼烧手术刀片，烫肝脏（心脏、脾脏等器官）表面，并迅速划小口 （2）用无菌接种环钩取组织，划线于普通琼脂、麦康凯琼脂，在37温箱培养24h观察。,2、抹片、染色、镜检 （1）抹片：用镊子夹取病变组织肝、脾等，然后以灭菌剪刀剪取小块，将其新鲜切面在玻片上压印或抹涂成薄层，自然干燥。将干燥好的抹片，涂抹面向上，以其背面在酒精火焰上来回通过几次，略做加热固定。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可在同一张玻片上有秩序地排好，做多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。,（2）染色：染色步骤为： 在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经12min，水洗。 加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用13min，水洗。 加95酒精于抹片上脱色，约051min，水洗。 加稀释的石炭酸复红(或沙黄水溶液)复染1030s，水洗。 吸干或自然干燥。 （3）镜检：,三、培养物鉴定 1、涂片、染色、镜检 先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合；均匀涂布成适当大小的薄层，干燥、固定。染色，镜检。,大肠杆菌革兰氏染色,2、纯化培养、鉴别培养 从单个菌落调取部分培养物，划线接种于麦康凯培养基，置37培养箱培养24h观察。 取出上次的病料 用火焰灼烧手术刀片，烫肝脏（心脏、脾脏等器官）表面，并迅速划小口 用无菌接种环钩取组织，划线于血琼脂平板，置37 CO2培养箱或烛缸中培养48-72h观察。,3、生化试验 糖发酵试验：葡萄糖（红）、乳糖（黄）、麦芽糖（蓝）、蔗糖（黑）、甘露醇（白） 靛基质试验（吲哚试验）：1%蛋白胨水培养基；靛基质试剂。培养24-48h，沿管壁加入吲哚试剂2ml，变红色为阳性，不变为阴性。 MR试验：培养基：蛋白胨水；甲基红试剂。培养2-7d，加入几滴甲基红试剂，变红者为阳性，不变的为阴性。 V-P试验：培养基：蛋白胨水； V-P试剂甲和试剂乙。培养2-7d，按每毫升培养基加入0.5ml6%a-萘酚酒精，再加入0.2ml40%KOH，混合均匀，静置观察2-4h。5min内变粉红色者为强阳性，数小时内变粉红色者为阳性，隔夜后仍不变色为阴性。,硫化氢试验：含醋酸铅的培养基。用接种针蘸取细菌的纯培养物，沿管壁穿刺接种，培养1-2d，穿刺线周围变黑色者为阳性，不变为阴性。 尿素酶试验：可购买尿素发酵管，操作方法同糖发酵试验，由黄变红的为阳性，不变的为阴性。 柠檬酸盐斜面：为绿色，表面划线。阳性：变兰；阴性：不变。 三糖铁斜面：为红色，先表面划线，再穿刺接种至管底。在斜面生长，产酸，培养基变黄；穿刺生长产酸产气，底部变黄，出现空隙；产硫化氢底部变黑。,根据试验结果判定所分离细菌为何种细菌。,生化试验结果,反应类型 葡萄糖 乳糖 靛基质 M.R V-P H2S 三糖铁 反应结果 大肠 + + - - 斜面黄色，底层变 黄有气泡，不产H2S 沙门 - - + - +/- 斜面红色，底层变 黄有气泡，部分菌株产H2S 巴氏 + - + - - + 底层产酸，斜面产酸 鸭疫 - - - - - -,