病毒的纯化和保存,病毒纯化目的(了解),为了了解病毒的结构、传染与免疫、遗传与变异等性质，常常需要高纯度的病毒,病毒纯化原理(熟悉),利用物理或化学的方法尽可能地去除宿主细胞中的组分，将病毒从其宿主细胞内提纯出来，在纯化过程中保持病毒的生物活性和感染性。,病毒纯化的一般原则(熟悉),1、释放病毒到胞外 1.1 容易释放病毒(培养液/尿囊液) 1.2 不容易释放病毒(细胞破碎) 2、去除细胞碎块 低速离心，以20006000r/min离心3040分钟，可除去90以上的细胞碎片和杂质 3、病毒悬液浓缩,细胞破碎方法(熟悉),超声破碎：密集的小气泡迅速炸裂，破坏细胞 高压匀浆：机械切割力 高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂 酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶 化学渗透：渗透压改变使细胞破裂 反复冻融：形成冰晶，使细胞膨胀破裂,病毒纯化方法 聚乙二醇(PEG)浓缩法,PEG是环氧乙烷和水缩合而成的水溶性非离子聚合物，无毒、无刺激性。 平均分子量不同，性质也有差异。分子量200600者常温下是无色无臭粘稠液体，分子量在600以上者就逐渐变为半固体状、蜡状固体。 随着分子量的增大，其吸湿能力相应降低。,不同分子量PEG性质比较,聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握),分子量20006000的PEG用于病毒浓缩 PEG可使病毒颗粒形成多聚体，较低离心力即可沉淀 (1)直接加入法 病毒悬液量少时候使用此法； 病毒悬液中加入8%-10%的PEG,聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握),(2)液体浓缩法,聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握),(3)固体浓缩法 将PEG固体覆盖于装有病毒悬液的透析袋上，进行浓缩。 透析袋孔径大小,超过滤法(熟悉),原理：利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将大分子或病毒等颗粒截留。 超滤膜孔径要比病毒颗粒小 只能去除比病毒小的细胞碎块,吸附法(熟悉),原理：病毒颗粒表面离子与吸附剂有亲和性，病毒吸附之后，使用适当的条件将病毒洗脱下来。 吸附剂必须具备的特点： 较大的表面积和吸附能力； 较高的吸附选择性； 便于洗脱； 性质稳定；,凝胶吸附法-磷酸钙凝胶,常用的凝胶，由0.5 mol/L CaCl2和0.5 mol/L Na2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物，用0.001 mol/L磷酸盐缓冲液悬浮，置于445天，使之充分沉淀后应用。,凝胶吸附法-氢氧化锌凝胶,是由7 mol/L氨水与0.1 mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH8.5)制备，在制备后数小时内较稳定。 方法：将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使它们形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5)解离回收病毒。,凝胶吸附法-焦磷酸镁凝胶,是由0.1 mol/L焦磷酸钠和0.1 mol/L MgCl2，以2：10(体积)比例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶。 将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于凝胶，然后用0.1 mol/L盐水洗2次，最后用0.3 mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒较好地回收于水相中。,红细胞吸附法(熟悉),用于某些与红细胞吸附的病毒的浓缩 选择适宜的动物红细胞：鸡红细胞 基本步骤：1) 1%-3%的红细胞与病毒悬液混合，2吸附1h以上； 2) 1000 r/min 离心10分钟，沉淀吸附病毒的红细胞，弃上清，生理盐水洗涤2次； 3) 用1/50原体积的磷酸缓冲液重悬红细胞沉淀，在37保温2-3h； 4) 1000 r/min 离心10分钟，上清即是浓缩的病毒悬液。,葡聚糖柱层析法(熟悉),葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。 最常见的是Sephadex 系列，主要型号是G-10 G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。,葡聚糖柱层析法(熟悉),Sephadex 的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex 的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。 G-25 分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离； G-200 分离范围 5000-600000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。,葡聚糖柱层析法,将初步浓缩的材料，通过葡聚糖G150或G200柱层析，然后用0.020.15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)洗脱，分部收集，测定280nm波长处的OD值，滴定各部分的效价，将含病毒的各部分相混合，再浓缩，透析之后，即可得到比较纯的病毒。 Nagano(1989年)用Sephacryls-1000柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。,葡聚糖柱层析法,差速离心法(掌握),原理：不同大小和比重的粒子有不同的沉降速度 适合分离沉降速度差别较大的粒子 适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放的病毒悬液中提纯病毒。 优点：能迅速处理大量样品，作为病毒提纯精制的第一步,常用方法(熟悉)：以低速(2000-3000 r/min)及中速(10000 r/min)离心20-30分钟去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质，再选择较高速度离心1-2h使病毒沉淀。,差速离心法,密度梯度离心,原理：将样品加在惰性密度梯度介质上进行超速离心，在一定的离心力下把样品颗粒分配到密度梯度介质中相等密度层中，吸出目的颗粒所在的介质层，从而达到分离纯化的目的。 常用的介质为氯化铯CsCl、蔗糖,1040蔗糖密度梯度制备,首先配置好不同百分比(w/v)的蔗糖溶液，然后在离心管中先加入浓度最小（10%）的溶液，然后用吸管加入浓度稍大的溶液，注意，加时吸管要插入离心管的底部，缓慢加入，务求界面分明。然后按上法依次分层加入其余各浓度的蔗糖溶液，即可配成蔗糖梯度液。 将事先用更低密度蔗糖溶液（小于10%）悬浮的样品轻轻加入10%蔗糖溶液的表面，进行密度梯度离心即可。,梯度混合仪,等密度梯度离心(掌握),原理：与密度梯度法相同，但不制备梯度介质，而是在样品中加入CsCl，离心过程中CsCl随离心力而下沉，形成连续密度梯度，样品中颗粒随其密度大小而下沉或上浮到相等密度梯层中。 每毫升病毒悬液加1g的CsCl，混匀，40000g离心24-36h。,病毒蛋白的分离 SDS-PAGE,PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳 Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。,PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。 催化聚合的常用方法：化学聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。,连续与不连续PAGE,PAGE按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。,不连续PAGE,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳，它由浓缩胶和分离胶两部分所组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度的凝胶上进行分离。 样品颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较连续电泳系统佳。,SDS-PAGE,SDS：十二烷基磺酸钠 (重点)SDS是阴离子去垢剂，使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。,SDS-PAGE,也称变性PAGE 通常采用不连续垂直型系统 浓缩胶、分离胶,浓缩胶,分离胶,首次应用SDS-PAGE的论文(了解),Laemmli UK (1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.,SDS-PAGE实验步骤(熟悉) 1、清洗、烘干、组装 电泳器材,SDS-PAGE实验步骤 2、1%琼脂封底,SDS-PAGE实验步骤 3、配制分离胶,SDS-PAGE实验步骤 4、灌注分离胶,灌注完后，加水覆盖隔绝空气， 同时可使界面平整,一般20-30分钟凝固,SDS-PAGE实验步骤 5、配制、灌注浓缩胶，插上梳子,SDS-PAGE实验步骤 5、往电泳槽加电泳缓冲液，上样,2上样缓冲液(样品溶解液 Loading Buffer)： SDS,琉基乙醇，甘油，溴酚蓝，Tris-HCl缓冲溶液。 蛋白样品与上样缓冲液1:1混合，沸水浴3分钟，离心，上样 其中一个上样孔：蛋白分子量标准,电泳缓冲液(电极缓冲液)包含SDS 一般配制成10或5,SDS-PAGE实验步骤 6、连接电源，电泳开始,SDS-PAGE实验步骤 7、电泳结束，剥胶，染色，脱色,染色液：考马斯亮蓝； 银染法用硝酸银 脱色液：甲醇/异丙醇+醋酸,按下式计算相对迁移率： 每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。,8、蛋白相对分子质量测定(重点),当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量,SDS-PAGE实验步骤 8、蛋白相对分子质量测定,注意的问题,蛋白质电泳 常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质,未聚合的聚丙烯酰胺具有神经毒性， 操作时要戴手套,Western Blot 蛋白质鉴定,Southern Blot：DNA Northern Blot：RNA Western Blot：单向电泳后的蛋白质印迹 Eastern Blot：双向电泳后的蛋白质印迹,Edwin Mellor Southern,Western Blot 蛋白质鉴定,原理(重点掌握)：将SDS-PAGE上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，让第一抗体与膜上的目的蛋白质的抗原决定簇结合，然后用经过特定酶标记的第二抗体结合第一抗体，加入酶的显色底物即可检测的目的蛋白条带存在与否。,Western Blot 步骤(熟悉),1、SDS-PAGE电泳结束后，不染色，进行转膜，把SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。(注意凝胶和膜的放置方向),Western Blot 步骤,2、膜的染色 (丽春红、氨基黑) 判断凝胶上的蛋白是否已经转移到膜上； 记录蛋白分子量标准/样品的位置；,Western Blot 步骤,3、磷酸缓冲液漂洗，进行膜的脱色 4、膜的封闭 封闭是用高浓度的无关蛋白质封闭膜上未被占据的表面，使抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有牛血清白蛋白BSA，脱脂奶粉等，一般用脱脂奶粉。 将膜浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。,Western Blot 步骤,5、结合一抗 (与目的蛋白结合) 将膜转移到含一抗的封闭液中，室温下轻摇孵育一小时。缓冲液洗涤三次 6、一抗与二抗结合 二抗是一抗的抗体 如果一抗是通过免疫兔子制备，即选择抗兔的二抗，如羊抗兔、鼠抗兔等。 缓冲液洗涤三次,Western Blot 步骤,7、显色 (1)生物素-