培养基配制及验收过程 培训课件,培训者:黄少云 培训日期:2012年11月,培训内容,前言,培养基质量的重要性,培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。,一、培养基概念,什么是培养基? 液体、半固体或固体形式的，含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖或保持其活力的物质。一般包括以下五大类： 无机营养物：氮、磷、钾、钙、镁等元素 有机物质：蔗糖、葡萄糖、氨基酸及其酰胺类等 生长刺激物质：吲哚乙酸、萘乙酸、玉米素等 其他附加物：如琼脂、活性炭、抗生物质等 其他对生长有益的未知复合成分：如椰汁、酵母提取 物、苹果汁、生梨汁等,二、培养基分类,按制备方法 即用型：如血平板 商品化脱水合成培养基：粉未、小颗粒等 添加试剂：如碘液、煌绿、亚碲酸盐卵黄等 按用途 增菌培养基 选择性：SC、TTB等 非选择性：营养肉汤、蛋白胨缓冲液等 分离培养基 选择性：EMB、HE等 非选择性：TSA、营养琼脂等 鉴别培养基 生化鉴定盒等 复苏培养基 PCA、琥红培养基等,三、培养基配制,1)在新开封的瓶子上标注开封日期 2)按标准和标签使用说明书进行配制和灭菌 配方计算 按配方正确称取各种培养基 在容器中加入少量蒸馏水后搅拌分散 加足所需水量 称量一种培养基用一个勺子，称完后需立即盖上瓶盖。 另外配制培养基时需戴口罩。,注意,三、培养基配制,3）pH值控制,四、培养基存放及有效期,干粉培养基：置阴凉干燥处，如特殊要求，按标签说明存放（部分培养基需特殊条件存放，例如SC,D/E肉汤,TSA琼脂等需放冰箱中保存） 基础培养基：室温下不超过一个月 28冰箱，不超过三个 划线分离用培养基： 28冰箱，保存一周,对于新开封的培养基：应对其质量进行检查，通过粉末的流动性，均匀性，结块情况和色泽变化等判断质量变化，发现受潮或物理性状发生明显改变时，则不再使用。,五、培养基配制的关键注意点,五、培养基配制的关键注意点,培养基的水化 培养基水化用具：不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入 培养基中,影响微生物的生长； 配制培养基用水：最常用蒸馏水或纯化水 （不能含有任何可能抑制或影响微生物生长的物质；最好 不要使用离子交换器（去离子）生产的去离子水，因其 微生物含量较高，这种水在过滤灭菌后仍可能带有细菌 生长的抑制因子）。,培养基的称量和复水 佩带口罩，防止吸入含有毒物质的培养基粉末； 先加入少量的水，充分混合，再加水至所需量； 称量要迅速，以免吸潮而影响称量的准确性，同时为避免增加培养基中的金属离子及其它微量化学元素，而影响微生物的生长、鉴定。,五、培养基配制的关键注意点,五、培养基配制的关键注意点,培养基的溶解 在培养基分装灭菌前，各成分应溶解均匀，使用 电炉等设备煮沸培养基时，应用小火加热，并边 加热边搅拌，避免培养基焦化或爆沸溢出。但含 有琼脂的培养基在加热前应该先浸泡几分钟。,培养基的分装 分装容器：有足够的空间，体积应比培养基体 积20%。,五、培养基配制的关键注意点,五、培养基配制的关键注意点,培养基的灭菌 及时密封，必须在配制当天(2h内最佳)进 行灭菌处理。注意灭菌时间与温度。,培养基的pH值 1、 为什么需调整培养基的pH值？ 微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长繁殖，或体现其生物特性。 2、调整培养基的pH值的方法： 应用1mol/LNaOH或1 mol/L HCl调整pH值，一般灭菌前比最终pH值高0.20.3。,五、培养基配制的关键注意点,培养基的pH值 3、注意事项： 不可反复调节pH，否则会影响培养基的渗透压，影响微生物生长。 购回的干粉培养基一般不需调节pH,但需确认pH在使用要求范围内. 验收时确认 每次配制确认，并填写记录,五、培养基配制的关键注意点,注意,五、培养基配制的关键注意点,培养基的保温 灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。 平时应该及时打开高压灭菌锅，取出灭菌培养基。,注意,五、培养基配制的关键注意点,干粉培养基使用原则 1、 应遵循先入先出的原则； 2 、一般贮存于阴凉干燥处,避免强光直 射。,五、培养基配制的关键注意点,已配制的培养基 1、建议平板倾注后立即使用； 2、在平板上标上制备日期和/或有效期和名 称； 3、固体培养基灭菌后的再融化只允许一次 ， 避免因过度加 热和潜在的污染影响培养 基质量。,特殊培养基配制 1、SC培养基：含有对光和热敏感的物质，只能煮 沸灭菌，煮沸后应该迅速冷却，并 避光保存。 2、TTB培养基：其添加成份煌绿、碘液对热不稳 定，应该在培养基冷却472 时加入。,五、培养基配制的关键注意点,五、培养基配制关键注意点,常见质量问题解答 培养基的质量保证常见问题.doc：,六、培养基验收,(一)培养基接收 对于新购回的培养基，分析员或实验助理接收时应该 检查如下信息: 名称 批号 包装规格及其完整性 数量 有效期 生产商的质检报告 检查信息无异常后，填写登记表 由分析人员在20天内开展培养基的验收工作,六、培养基验收,(二)培养基验收方法：不同的培养基，有相应的培养基质量监控标准 TSOP-27-004 监控项目： 物理指标 包装及其完整性 色泽或形态 溶解后色泽 澄清度 最终pH值 微生物要求 微生物污染测试 选择性和特异性试验 生长率 生化鉴定试验,六、培养基验收,(三)培养基验收项目中的标准来源 pH值标准来源：培养基相对应的检测方法：如 HE培养基用于沙门氏菌的检测，其pH值标准可在 GB4789.4-2010 沙门氏菌检测方法中获得 其余验收项目的标准来源: 首先 SNT 1538.2-2007 第二 供应商提供的质检报告 第三 结合本检测室的实际需要,六、培养基验收,(四)验收中的微生物要求 微生物污染测试：从每批制备好的培养基中选取至少一个平板或试管，置于37或按特定标准中规定的温度培养18h.（此项只适用于即用型培养基）,六、培养基验收,(四)验收中的微生物要求 微生物生理生化特性：,生长率测试测试培养基对目标菌的促生长能力,选择性测试-测试培养基对非目标菌的抑制能力,特异性测试测试培养基的指示能力,六、培养基验收,固体培养基的测试方法 定量测试方法(不适用于部分霉菌培养基) 涂布法或倾注平板 生长率PR 选择因子SF(必要时) 半定量测试方法 3mm接种环划线 G 6 其适用于固体,液体培养基.仅作固体培养基 的补充测试. 定性测试方法:作固体培养基的补充测试,六、培养基验收,液体培养基测试方法 定量方法:适用于新制备的培养基,肉汤或稀释剂 半定量方法 a目标菌10-100CFU/ml+非目标菌1000CFU/ml b非目标菌1000CFU/ml 注: 混合菌液培养后划线,目标菌于选择性平板 上10CFU，非目标菌培养后划线,于非选择性 平板上10CFU 定性方法,六、培养基验收,实际操作中，各方法应用操作介绍： 1)定量方法：适用于非选择性和选择性固体培养基(但不适用部分霉菌培养基） 采用生长率(回收率)表示 其方法是依据培养基特性或质检报告选择目标菌株 可用倒板法或表面涂布法接种目标菌株 按要求培养后计算其生长率。,六、培养基验收,生长率PR的计算： PR =NSNo NS:从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数 No :从一个或多个规定的参考培养基上获得的菌落总数 注：菌落总数应100CFU 参考培养基：一般可选用旧批号的已验收合格的同品种的 培养基 ，菌落总数计数也可用TSA培养基。 要求：每平板(或每试管)的接种目标菌：10 CFU100CFU。 非选择性培养基PR 0.7； 选择性培养基PR 0.1；,六、培养基验收,2)定性法：用于选择性培养基或划线即用型分离平板(如血平板) 测试方法：制备平板 用3mm接种环取测试菌株，在平板表面划线 按标准中规定的培养时间和温度进行培养 培养后观察并评价 评价方法： 0：相当于不生长 1：相当于弱生长 2：相当于强生长 注：目标微生物的分数应该是2，并且要有典型的特征，大小和菌落形态，非目标微生物的生长应该被全部或部分抑制(0或1),六、培养基验收,3)半定量测试方法：选择性和特异性，适用于液体的增菌培养基 测试方法： 取配制好的培养基或配制成每份10ml的样品进行测试 取一份样品接种目标菌、非目标菌混合菌：即在装有测试 肉汤的试管中接种10CFU100CFU的目标菌，同时接种大于 1000CFU的非目标菌，混匀； 取一份样品接种非目标菌：在测试肉汤中接种大于1000 CFU的非目标菌，混匀培养； 按标准方法中规定的培养时间和温度进行培养； 用3mm接种环取一环混合菌培养液划线至特定目标菌选择 性平板上,六、培养基验收,用3mm接种环取一环非目标菌培养液划线至非选择性平板(如TSA)上； 将两个平板按标准要求培养(见特定的检测方法中) 评价方法：观察培养后的肉汤 0：表示无混浊 1：表示很轻微混浊 2：表示严重的混浊 混合菌液肉汤浊度应为2，非目标菌肉汤浊度应为0 选择性平板上有至少10个目标菌菌落生长，表示生长率为良好。 非选择性平板上没有菌落生长(或者少于10CFU)，表示选择性为良好。,七 SN 1538.2-2007中质控例,八 监控标准存在的改进问题讨论,(1) SN/T 1538.2-2007 4.2.2中提出： 微生物污染测试，只适用于即用型培养基。 改进 监控标准中：除血平板及生化鉴定盒，其余干粉培养基可不测这个项目？,(2) SN/T 1538.2-2007 5.1中提出: 通常使用半定量和定性测试方法就能满足实验室对培养基性能测试的要求. 评价新的培养基或新的供应商的产品时应采用定量测试方法. 即 定量法：适用于培养基生产厂家或对培养基质 量有特殊要求的实验室 半定量法：适用于实验室对固体培养基的质控 定性法： 适用于实验室对液体培养基和鉴别培 养基的质控,八 监控标准存在的改进问题讨论,改进：简化验收标准，减少工作量 用于计数的固体培养基仍可以用定量法进行验收，但是用于划线分离的选择性培养基是否可以只用定性法验收？ 选择性增菌液是否也可以只用定性方法验收？那么就只需做到看加入目标菌后培养后的浊度值，而不用后续的划线分离观察菌落的典型形态？,八 监控标准存在的改进问题讨论,Thank You !,