1第一章 色谱分析概论1.1 色谱法历史回顾在 1903 年 3 月 21 日，被称为色谱之父的俄国植物学家 Tswett 首次在华沙自然科学学会生物学会会议上报道“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用” ，即：将一植物叶子色素的石油醚提取液从白色的主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用石油醚淋洗，结果发现当色素在柱中向下移动时有明显的不同颜色的色带出现并以不同速率从柱上洗脱下来。他称这一色带为色谱，相应的研究方法叫色谱法。实际上，色谱这一词源于希腊语“chroma”（颜色）和 “graphein”（图谱）的组合。那时，Tswett 预测这一技术也能同样用于无色物质的分离。他进行了各种研究，但当时化学家的主要兴趣是大量物质的分离和纯化，Tswett 分离研究的物质都是微量的，同时由于他还不是一位著名的植物学家,因此，在他的一生中，他的工作一直未受到重视。直到 1930 年，Tswett 的色谱技术受到 Kuhn,Winterstein 和 Lederer 的关注。他们用碳酸钙装填的玻璃柱分离了鸡蛋黄中的成分，鉴定出两种化合物：叶黄素和玉米黄质。在另一实验中，他们将胡萝卜提取物通过氧化铝柱进行分离，鉴定出胡萝卜素中含有两种生物学上很重要的物质 和 胡萝卜素，色谱技术由此重新活跃起来。在 1940 年，Martin 和 Synge 提出液-液分配柱色谱法，他们用此方法分离了氨基酸的乙酰化衍生物，所用的固定相是吸附在硅胶上的水，流动相为与水不互溶的有机溶剂氯仿。1941 年，Martin 和 Synge 发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法，因而获得了 1952 年的诺贝尔化学奖。在此基础上,1957 年Golay 开创了开管柱气相色谱法即毛细管柱气相色谱法。1956 年 Van Deemter等在前人研究基础上发展了描述色谱过程的速率理论。1965 年，Giddings 总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱发展奠定了理论基础。另一方面，早在 1944年 Martin 的合作者 Consden 等人发展了纸色谱，1949 年 Macllean 等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法得以实际应用。在上世纪 60 年代末，由于把从气相色谱得到的广泛的理论和实践上的经验应用于液相色谱系统的设计，以及在机械、光学和电子、柱填料等技术上的进步，出现了高效液相色谱。上世纪 80 年代初，超临界流体色谱得到发展，但在 90 年代后未得到较广泛的应用。而在上世纪 80 年代初，由 Jorgenson 等集前人经验而发展起来的毛细管电泳，在 90 代后期受到重视，近年来还在继续发展中。经过 100 余年的历程，色谱法确实获得了其它分离技术无可比拟的、令人瞩目的发展，而 GC 和 HPLC 在所有色谱方法中是发展最快、应用最广、理论和实践最为成功的典范。由于它们均具有分离效率高、应用范围广、重复性好、灵敏度高、分析速度快，可与多种波谱技术联用等优点，因而已成为生命科学、食品科学、材料科学、环境科学以及航天科学等研究领域重要的分离分析手段。GC 和 HPLC 分析方法及其在食品与发酵学科的应用将是下面有关章节着重讨论的内容。1.2 色谱法的分类按两相物理状态分类 以气体为流动相的称为气相色谱，以液体作为流动相的称为液相色谱。固定相可以是液体或固体，因此，气相色谱又可分为气-固色谱和气- 液色谱；液相色谱也可分为液-固色谱和液-液色谱。另有一类叫化学2键合相色谱，是通过化学反应使固定相与固态载体表面的特定基团，例如硅胶表面的硅羟基发生化学键合，在载体表面形成均匀的固定相层。该类键合相具有耐高温、耐溶剂、不易流失的特性，在气相色谱、高效液相色谱中广泛使用。从本质上讲，化学键合相也属于气-固或液-固色谱。当流动相是处于临界温度及临界压力以上高度压缩的流体时，称为超临界流体色谱。按固定相形态分类 把固定相装填在圆筒形柱管中的称为柱色谱。把固体固定相涂敷在玻璃、塑料或金属板上的叫薄层色谱，用滤纸作固定相或固定相载体的叫纸色谱。薄层色谱和纸色谱又统称为平板色谱。按分离机理分类 可以把色谱分为四类：分配色谱基于被分离组分在两相中的分配系数不同；吸附色谱基于被分离组分对活性的固定相表面吸附力的不同；离子交换色谱利用不同离子与固定相上的相反电荷离子间作用力大小的不同进行分离；体积排阻色谱利用固定相孔径的不同，把被分离的组分按分子大小分开的一种色谱分离方法。根据固定相和流动相相对极性大小来分类 在液相色谱中若流动相的极性比固定相的极性小称为正相色谱；若流动相极性大于固定相的极性，称为反相色谱。按动力学过程分类 色谱法有迎头法、置换法和冲洗法三种展开方式。迎头色谱法是将要分离的混合物样品溶液连续注入色谱柱中，样品本身也起流动相的作用；该法仅能得到第一个流出的纯组分，后面流出的均是混合物。现在，除了纯化溶剂外，这种方法已很少使用。置换色谱法是一种组分被另外一种组分或试剂（流动相中）从固定相上置换出来的分离方式。用置换法分离时，各个被分离组分的谱带是紧靠在一起的，很难得到 100%的定量回收，因此，这种方法主要用于大规模的制备分离。与置换法不同，在冲洗色谱法中，各组分谱带之间被流动相隔开，所以冲洗色谱法是色谱中分离最完全的展开方法，因而是目前采用最多的分离方式，绝大多数色谱分析是冲洗法。1.3 色谱法过程和原理色谱法是一种物理化学的分离和分析方法。它一般包括分离和检测两部分，且同时进行。色谱法分离分析混合物样品中各组分的过程和原理是：同一时刻进入色谱柱中的不同组分，由于在流动相和固定相之间的溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的大小不同，即分布系数（常叫分配系数）有差异，因而在随流动相运行并在两相间进行反复多次分配的过程中移动速度不等,产生明显的“差速迁移” （图 1.1） ，经过一定长度的色谱柱后，彼此分离开来，按不同时间顺序流出色谱柱而进入检测器产生信号，并由记录仪、积分仪或色谱工作站记录下来，且显示出各组分的色谱流出曲线（色谱图）及其保留时间、峰面积等谱峰数据。一般情况下，不同物质具有不同的保留时间，同一物质的峰面积与其含量成正比，因此，保留时间可用于色谱峰的对照定性，峰面积则用于定量计算。3图 1.1 色谱过程示意图1.4 色谱的有关术语和概念1.4.1 分布系数（distribution coefficient）在上述色谱分离过程中，各组分的分布系数（或分配系数partition coefficient）的差异是其分离的实质性原因。色谱的分布系数是指在一定温度下，被分离组分（溶质）分别在固定相和流动相中的浓度之比，以 K 表示如下式：K= （1.1）Cms式中 Cs单位体积固定相中溶质的质量；Cm单位体积流动相中溶质的质量。分析型色谱体系中，一般溶质（样品组分）的用量很小，可作稀溶液处理。则：lnK=- =- (1.2)RTG 是溶质在固定相和流动相中的化学位之差；G 是溶质的分配自由能 K 是溶质在两相中分布平衡性质的量度，反映了溶质和固定相、流动相作用力的差别，它决定于流动相、固定相和溶质分子的化学结构，而与柱管特性和仪器无关。1.4.2 容量因子4描述溶质在固定相和流动相中分布特性的另一重要参数是容量因子（capacity factor）,也称分配容量（partition capcity）或容量比（capcity ratio） ，用 k 表示。其定义为：在平衡状态下，溶质在固定相和流动相中分配量（重量或摩尔数）之比，可用下式表示：k = = =K =NmsCVsK式中：Ns、Nm 分别为溶质在固定相和流动相中的量；Vs、Vm 分别表示固定相和流动相的体积。叫做“相比” （phase ratio） ，其含义是在色谱柱中流动相体积和固定相体积之比。它是色谱柱的结构参数之一。k 是选择控制色谱条件，反映色谱保留行为的一个重要参数，它不仅与固定相、流动相的性质及温度有关，还与色谱柱床的结构有关，但与流动相流速及柱长无关。1.4.3 色谱图在 1.3 中已提及色谱图即色谱流出曲线，它是柱流出物通过检测器产生的响应信号（以电压或吸光度等单位表示）对时间或流动相流出体积的关系曲线图（图 1.2） 。它能说明色谱柱效和分离情况，是定性定量的依据。色谱图通常有下列两个基本特征：在适当的色谱条件下，样品中每个组分均有相应的色谱峰，色谱峰一般呈对称的 Gaussian 曲线。色谱峰宽与组分的洗出时间一般呈线形关系。若连续的色谱峰中一个峰的宽度不规则增大，则该色谱峰中可能含有一个以上组分。图 1.2 色谱流出曲线图 1.4.4 基线 在正常操作条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的连续的响应信号，一般是一条直线。51.4.5 峰高 从峰的顶点向基线作垂线的距离，即图 1.2 中的 h。1.4.6 峰面积 色谱曲线与基线间所包围的面积，即图 1.2 中 CBD 所围成的面积，用 A 表示。1.4.7 区域宽度区域宽度是色谱流出曲线中很重要的参数，它的大小反映色谱柱或所选色谱条件的好坏。区域宽度有以下三种表示方法：半高峰宽（peak width at half height） （W h/2）在峰高一半处的色谱峰的宽度，即图 1.2 中的 GH，单位可用时间或距离表示。峰(底 )宽（ peak width） （W）在色谱峰两边的拐点处作切线，在图 1.2 中于基线上相交于 I,J 处，此两点间的距离叫峰(底)宽。标准偏差（）在图 1.2 中 EF 距离（0.607 倍峰高处的峰宽）的一半叫标准偏差。在这三种表示方法中以前两者使用较多，三者的关系是：W=4 （1.3）Wh/2=2 =2.354820 （1.4）2ln1.4.8 保留值（retention value ）保留值是样品各组分在色谱体系或色谱柱中保留行为的量度，它反映样品组分与固定相（液相色谱中还包括流动相）作用力的大小。具体的保留参数主要有下述几种。(1)死时间（dead time） tM 一些不被固定相保留的惰性物质通过色谱系统所需的时间。例如在气相色谱中，用热导池作检测器时，从注射空气样品到空气峰顶出现时的时间。以 s 或 min 为单位表示。(2)死体积（dead volume） （V M） 指色谱柱中不被固定相占据的空间及进样系统管道和检测系统的管道与流动池的总体积，等于死时间乘以流动相的流速。(3)保留时间（retention time） （t R） 从注射样品到色谱峰顶出现时的时间，以 s或 min 为单位表示。(4)调整保留时间（adjusted time） （t R） 保留时间减去死时间即为调整保留时间（t R-tM） 。(5)保留体积（retention volume） （V R）组分从进样到峰顶出现时所需流动相的体积。一般可用保留时间乘流动相的流速求得，以 mL 为单位表示。(6)调整保留体积（adjusted retention volume） （V R）保留体积减去死体积即为调整保留体积（V R-VM） 。(7)净保留体积（net retention volume） （V N）经压力修正的调整保留体积。即VN=j V R （1.5）式中 j色谱柱进口和出口之间的压力梯度校正系数。该参数仅在气相色谱中使用。6j=