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Western Blot问题指南时间:2011-05-13 08:55来源:网络 作者:admin 点击:3679次根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!); 1. 参考书推荐 A. 对初学者看什么资料比较好? 解答:抗体技术实验指南和Antibodies(a laboratory manual,根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!);1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好?解答:抗体技术实验指南和Antibodies(a laboratory manual, wrote by Ed Harlow ,david lane)两本书不错。2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot (以下简写成Western Blot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120g,换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。E 我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?解答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加510甲醇。F. 想分离的蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗?解答:260kd的蛋白不好做, 分离胶用6, Stacking Gel 3.5。G. 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的 comb。H. 蛋白变性后可以存放多久?解答:80,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。I. 我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分离胶应当采用7.5%,但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11的配方,不知为何?解答:上述您提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置。J. 接下来我准备采用DAB显色技术,二抗是生物素化的多克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点K. 还有一问题,一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?解答:Western Blot一般上样30100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳 性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适 合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。L. 做组织样品的western的时候,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?解答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更 好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活 性(加入PMSF和蛋白酶抑制剂 cocktail),封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体,使用BSA也是不错的选择。M. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?解答:做200kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。N. 有什么方法可以提高上样量?解答:可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。O. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白,膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机,有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法,42kd的蛋白分子量算不算大?解答:如是需要提取膜蛋白,(而不是只需要提取膜蛋白),可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白,用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大,也不算小,所以,可以按照一般的转移方法实施。P. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求?解答:上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等, 如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了, 但是不要超过0.3g/mm2。Q. 一抗,二抗的比例是否重要?解答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。3. 抗体R. 做细胞信号传导,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?解答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。S. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好,所以没做预试,怕费时间,用什么样的稀释度比较好呢?我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜,一抗孵育也是过夜的,若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。解答:不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀 释度也是不一样的,需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧,转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦,何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间,还要看 你的目的蛋白分子量的大小;转膜的设备,是半干式,还是湿式。一抗当然可以过夜,如果你想所短 Western Blot时间的话,可以增高一抗的孵育温度,我们实验室一般37度,两小时就足够了;你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度,你可以一抗 1:1500;二抗1:20000试试。另外建议你洗膜时,多洗几次,最好是在封闭;一抗和二抗后至少是5x5min,跑一张好膜不容易,多尽点心吧,这 样不会浪费你的时间,只会节省你的时间!T. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?解答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇 (又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后 变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形 表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗)U. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用23次。稀释后应在23天内使用,4度保存,避免反复冻融。4. 滤纸、胶和膜的问题V. NC膜 PVDF膜 尼龙膜怎样鉴别?解答:尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种类型;硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物,价格最便宜;PVDF膜介于二者之间。就结合能力而言:尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480600g/cm2,可结合短至10bp的核酸片段;硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80100g/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125300g/cm2。就温度适应性而言:尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。就韧性而言:尼龙膜较强;硝酸纤维素膜较脆,易破碎;PVDF膜较强。就重复性而言:尼龙膜可反复用于分子杂交,杂交后,探针分子可经碱变性被洗脱下来;硝酸纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。W. 在做Western Blot时,PBDF膜用甲醇浸泡的目的?解答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。X. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗?解答:可以。AA. 转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端(即点样空的一侧)的转膜好象不是很好,为什么?解答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢, 你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法,还是用上样缓冲液?解答:用上样缓冲液,这样有几个好处,可以提取总蛋白,同时又可以让磷酸化酶失活。CC. 采用tank system有什么讲究?解答:建议低电压,长时间,(一般tank System 用衡压好点),如 28V 1416hrs。DD. 做HSP WESTEN定量,同样的抗体免疫组化能做出,而WESTEN却不能?解答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做Western Blot和IHC。EE. 膜一般要如何处理?解答:一般用甲醇泡泡就可以了。 FF. 如果是68转印膜,要加多少一抗?解答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为35ml。GG. 上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果。解答:无要求。HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗?解答:没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿 保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜,胶里的水分被蒸发,采用保鲜膜包上也可以;也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题,你可以重新配制 一份观察;能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂,避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究?解答:如果是用的是半干转,顺序为:阴极滤纸胶膜滤纸。滤纸的长宽分别比胶小12mm,而膜的长宽分别比胶大12mm。绝对禁忌:上下两层滤纸因为过大而相互接触,这样会短路,电流不会通过胶和滤纸。JJ. 蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?解答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd和66kd可以一起转,12SDS-PAge, 湿转36V , 35hrs就可以了, 可以根据你实验室的经验调节;170kd 用7%SDSpage, 48V 10hrs16hrs。KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?解答:可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓 度)(优化的转移缓冲液,可以参考
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