,凝胶柱层析 分离纯化蛋白质,学习目的,了解：层析技术的基本原理; 有效分配系数Kav的计算。 理解：凝胶的选择和准备。 掌握：凝胶层析的原理和操作方法; 有效分配系数Kav的意义。,重点： 1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。 2、分配系数与被分离分子量之间的关系。,蛋白质的分离纯化,蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。,凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。,凝胶层析的基本原理,凝胶：一些具有立体网状结构 和一定孔径的高分子化合物。,分子大于凝胶孔隙范围的物质： 随着溶剂在凝胶颗粒间流动,分子小于凝胶孔隙范围的物质： 渗入凝胶颗粒的孔隙中,凝胶层析的过程,凝胶层析过程的数理关系,凝胶干体积Vg,柱床体积Vt,= Vg + Vo + Vi,洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积。,凝胶层析的分配系数,分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被凝胶排阻的程度。 Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体积Ve有关： Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化 ，分离物分子量越大Kav值越小,Kav = （Ve Vo）/（Vt Vo）,葡聚糖凝胶柱层析法的特点,天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。 人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。 葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过 1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶 水的多孔网状高分子化合物。 型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15,Sephadex的常见规格（分级范围）,X： 交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子量产品。反之亦然。 吸水量。G-25表示：1g干胶吸水2.5mL，依次类推。,葡聚糖凝胶柱层析法的特点,聚丙烯酰胺葡聚糖（Sephacryl）：烯丙基葡聚糖和N,N-亚甲双丙烯酰胺的交联共聚物 型号：S-100,S-200,S-300,S-400等,Sephacryl的常见规格（分级范围）,预装柱,车间现有规格 1000100000,凝胶层析的实际操作,1、样品准备 1.1、根据Phenyl下样合格样品的体积，加入3.5 mol / L (NH4)2SO4溶液，使样品中(NH4)2SO4溶液浓度稀释到1.351.83mol / L。置于层析柜中10 min以上。4，6500 rpm离心30 min，收集沉淀。用pH 7.2士0.1的5mol / L PB溶解沉淀，完全溶解后，4，6500 rpm离心15分钟，取上清。 2、前处理 2.1、0.5mol / L NaOH以22cm/h线性流速冲1.5%的柱床体积，再用注射用水冲中性 3、平衡 3.1先用4L200 mmol / L PB以22cm/h线性流速平衡 3.2再用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB以22cm/h线性流速平衡层析柱，不时检测出液端穿液电导和pH，如果与平衡液的电导和pH一致，表明层析柱已经平衡好。,凝胶层析的实际操作,4、上样 上样体积不大于6%柱床体积，上样浓度控制再35mg / ml50 mg / ml，以不大于12cm / h线性流速上样。 5、洗脱 用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB溶液，以不大于12cm / h线性流速洗脱,凝胶层析的操作注意事项,1、盐析过程盐溶液加少，盐析程度不够；盐溶液加多，盐浓度过高有可能会导致蛋白变性； 2、蛋白的上样浓度不宜过高（70 mg / ml GE公司凝胶手册数据 ），否则样品粘稠影响分离效果； 3、样品必须是均匀的溶液体系，没有颗粒，否则容易造成柱子阻塞；,思考题,为什么分离物分子量越大Kav值越小？ 用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎样才能得到较好的分离效果？,