第十三章 可见分光光度法和紫外分光光度法,Visible Spectrophotometry and Ultraviolet Spectrophotometry,内容提要,物质的吸收光谱 分光光度法基本原理 透光率和吸光度 LambertBeer定律 可见分光光度法 分光光度计 测定方法 4. 提高测量灵敏度和准确度的方法 5. 紫外分光光度法简介,教学基本要求,掌握分光光度法的基本原理，LambertBeer定律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数等基本概念及相互关系。 熟悉物质对光的选择性吸收，吸收光谱的意义；可见分光光度法的测定方法标准曲线法和标准对照法。 了解光的基本性质，光的加和性；分光光度计的基本构造；提高测量灵敏度和准确度的方法；紫外分光光度法的一般概念。,第一节 物质的吸收光谱,一、物质对光的选择性吸收 光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为激发态，只有当分子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时才能被吸收。 M(基态)+ h M*(激发态) 物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。,第一节 物质的吸收光谱,互补色光示意图,第一节 物质的吸收光谱,二、物质的吸收光谱 将不同波长的单色光依次通过有色溶液，测量溶液的吸光度A(absorbance)。 以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸收曲线，或称吸收光谱。 吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用max表示。 一般，max是定性鉴别物质的基础 。 不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。,第一节 物质的吸收光谱,三(邻二氮菲)合铁(II)离子的吸收光谱图(absorptionspectrum) max=510nm 不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比。,第二节 分光光度法基本原理,一、透光率 (transmittance)和 吸光度(absorbance) 入射光强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It， 反射光强度为Ir I0 Ia + It + Ir 被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为 I0 Ia + It,第二节 分光光度法基本原理,一、透光率和吸光度 透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率(transmittance)，用T表示 透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。,第二节 分光光度法基本原理,二、LambertBeer定律 Lambert- Beer定律： A =bc 溶液厚度b，单位cm；浓度c，单位molL-1； 摩尔吸光系数(molar absorptivity ) 单位:Lmol -1cm-1 若用质量浓度代替c A ab 质量吸光系数(apercentange absorptivity) 单位:Lg -1cm-1 a和可通过下式相互换算 aM,当溶液组成表度为10 gL-1时，吸光系数可用 比吸光系数 表示， 与和a的关系分别为：,第二节 分光光度法基本原理,第二节 分光光度法基本原理,透光率T与溶液浓度c (或液层厚度b)之间的关系也可以以指数函数关系来表示： - lgT bc T 10-bc,第二节 分光光度法基本原理,应用LambertBeer定律时，需注意以下几点： LambertBeer定律仅适用于单一波长的单色光。入射光的波长范围越宽，则测定结果越容易偏离LambertBeer定律。 吸收过程中各物质间无相互作用，但各物质的吸光度具有加和性。即 A Aa+ Ab + Ac + 入射光波长不同时，摩尔吸光系数也不同。摩尔吸光系数越大，溶液对入射光的吸收就越强，测定的灵敏度就越高。 分光光度法仅适用于微量组分的测定。(或a)确定是在低浓度下测定吸光度A，通过计算求出。,第二节 分光光度法基本原理,例13-1 已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmolL-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数及质量吸光系数a。,第二节 分光光度法基本原理,解 由LambertBeer定律可得 已知 c 0.15010-3molL-1，b 2.00cm， T 0.398 代入,第二节 分光光度法基本原理,例 测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度 如下：A(280nm) 0.46， A(260nm) 0.58 试计算每一组分的浓度。 已知：酶的(280nm) 2.96104Lmol-1cm-1 (260nm) 1.52104Lmol-1cm-1 AMP的(280nm) 2.4103Lmol-1cm-1 (260nm) 1.5104Lmol-1cm-1 吸收池厚度为1.00cm。,第二节 分光光度法基本原理,解 设酶和AMP的浓度分别为y和z 因吸收光的加和性 为260nm 0.58 1.521041.00 y+1.51041.00 z 为280nm 0.46 2.961041.00 y+2.41031.00 z 解方程得：y 1.410-5 （molL1） z 2.510-5 （molL-1） 即 酶的浓度为1.410-5 molL1， AMP的浓度为2.510-5 molL-1 。,第三节 可见分光光度法,一、分光光度计 (spectrophotomete ) 主要部件 光源 单色器 检测器 吸收池 指示器 光源：钨灯，发出3203200nm的连续光谱， 单色器：以棱镜或光栅分光，提供单色光。 吸收池：分光光度计中用来盛放溶液的容器。 检测器：通过吸收池的光转换为光电流，再经放大输入指示器，然后显示。 指示器：显示A或T 。,第三节 可见分光光度法,(a)自准式单色器示意图 (b)棱镜对光的色散作用(c)平面反射光栅,第三节 可见分光光度法,二、测定方法 标准曲线法 取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。 在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液度。,维生素B12的标准曲线,第三节 可见分光光度法,标准对照法 预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液(其浓度用cs表示)，测得其吸光度为As，再测定待测液的吸光度Ax，则待测液浓度cs可从下式求得,第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法,一、分光光度法的误差 仪器测定误差 光电管灵敏性差、光源不稳定及读数不准。 透光率误差T引起浓度误差c： 透光率20% 65%，A为0.20.7时，浓度相对误差较小。,测量误差和透光率的关系,第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法,溶液偏离Beer定律 偏离Beer定律，A-c曲线弯曲。主要原因： 化学因素 吸光物质发生解离、缔合、溶剂化等现象； 光学因素 复色光引起对Beer定律的偏离。 主观误差,两种不同吸光系数的混合光对Beer定律的偏离,第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法,二、提高测量灵敏度和准确度的方法 选择适当的显色剂 灵敏度高 选择性好 显色剂在测定波长处无明显吸收 反应生成的有色化合物组成恒定。,第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法,选择合适的测定条件 入射光波长的选择 显色剂的用量 溶液的酸度 显色时间和温度 空白溶液的选择 溶剂空白 试剂空白 试样空白,共存离子的干扰及其消除 控制显色反应的酸度 加入掩蔽剂 分离干扰离子,第五节 紫外分光光度法简介,一、752型分光光度计 紫外分光光度法适用测定在近紫外区(200380nm)有特征吸收的物质。 752型分光光度计装有可转换的适用于可见分光光度法的钨灯光源和适用于紫外分光光度法的氢灯光源(发射200400nm)。 紫外光不能透过玻璃，故紫外分光光度计中光栅 、透镜、氢灯和光电管以及吸收池等均须用石英制造。,第五节 紫外分光光度法简介,752型分光光度计的光学系统示意图,第五节 紫外分光光度法简介,二、紫外分光光度法的应用 定性鉴别 比较max、(max)或a(max) 比较吸光度(或吸光系数的比值) 定量测定 有机化合物的结构分析,