一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程： 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞1，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)； 6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增) 2.回收 A 酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。 B PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。 实验仪器：1、琼脂糖凝胶电泳系统2、紫外观察分析仪3、离心机4、单面刀片5、恒温水浴锅试剂 ：1、DNA回收试剂盒2 2、50TAE3（电泳缓冲液Tris-乙酸）3、ddH2O4、琼脂糖凝胶4步骤：1）使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳（分离DNA作用）5。2）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖。放入1.5ml离心管中。3）按每100mg琼脂糖加入300600l 溶胶液6的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。4）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体。再将吸附柱放入同一个收集管中。5）在吸附柱中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6）再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。7） 12000rpm 室温空离心1分钟。8）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20。9）琼脂糖凝胶电泳（鉴定作用）检测回收产物。 注意事项：1）切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛；2）溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。3）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。4） 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率3连接器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。 试剂：T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 。操作步骤 ：PCR产物（已纯化回收）与T载体直接连接： （1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416C。 （2） 取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）4ml 目的基因 ；1ml T载体 ；0.5ml T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）；1ml 连接酶缓冲液10 x buffer ；3.5 ml dd Water ，总量10ml 体系。 （3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C干式恒温仪（或14C水中）中保温过夜（12-16h）。 （4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。 4. 转化原理：目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的片段与感受态细胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。 目的：连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒。器材：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。试剂：1.LB固体和液体培养基7 2.含特定抗生素的LB固体培养基3.100mM CaCl2溶液。4.待转化质粒大肠杆菌感受态细胞制备步骤：1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB液体培养基 ，37振荡培养过夜（12h左右），直至对数生长期。2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37振荡培养23h，至OD600值达到0.5-0.6之间。3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。4）4离心10min（4000r/min）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞，立即冰浴30min7）4离心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）9）分装细胞，200ul一份，4保存。 暂且不用的贮存于-70可保存半年。 取其中一份进行转化。质粒DNA的转化1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min2）离心管放到42水浴锅中保温90s（90s一定要精确，不要摇动试管）3）将试管迅速转移到冰浴，冷却1-2min4）每管加800u l LB液体培养基，37培养1h5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在含有适当抗生素的LB固体培养基上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，室温正置30min6）倒置平皿37，1216h，出现菌落为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。 5抽提质粒（碱裂解法提取质粒DNA)原理： 本实验采用碱裂解法进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。1）用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA。两种DNA在强碱环境都会变性。2）当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值后，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA分子巨大，难以复性。3）通过离心，大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质沉淀（SDS的作用下）除去，而质粒DNA留在上清中。4）再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。试剂：1.溶液: 50mM(mmol/L)葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1MTris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min，贮存于4。2.溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置（NaOH作用是使细胞裂解）。3.溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存备用。4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4保存备用。5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4保存备用。8溴化乙锭（EB）：10mg/ml 9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20。 10. 6loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。 11. 1%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5g/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5