1 Leica 激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013 年年 3 月月 2 目录：目录： 1 系统的组成系统的组成 系统组成系统组成.3 光路示意图光路示意图.4 2 系统的使用系统的使用 2.1 开机顺序开机顺序.5 2.2 软件软件界面简介界面简介.7 2.3 在显微镜下观察样品在显微镜下观察样品.8 2.4 采集共聚焦图像采集共聚焦图像.9 2.5 XYZ三维扫描（三维扫描（Z-Stack）11 2.6 时间序列扫描（时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan）15 2.7 波长扫描（波长扫描（xy Scan）16 2.8 HyD检测器检测器.17 2.9 图像的保存及输出图像的保存及输出.18 2.10 关机关机.20 3 系统的维护系统的维护.21 3 Leica SP8 系统组成图系统组成图 4 1 1 可见波长激光或白激光 1515 UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2 2 声光调制器（AOTF） 1616 扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3 3 红外激光（IR）* 1717 在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4 4 电光调制器 1818 物镜（可提供各种选择）* 5 5 紫外激光* 1919 在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 6 AOTF或直接调制器（DMOD） 2020 正方型针孔 7 7 STED 激光* 2121 Fluorifier盘* 8 8 Setlight监控二极管 2222 X1出口接口* 9 9 AOBS, 及其他选配件 2323 外置检测器* 1010 用于FRAP的光束增强镜* 2424 色散棱镜 1111 红外激光耦合 2525 分开的荧光光谱 1212 与CS2紫外光路耦合的紫外激光 2626 最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 1313 STED激光耦合 *选配组件 1414 全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件 5 2 系统的使用系统的使用 2.1 开机顺序开机顺序 （硬件标号请参考前面的系统组成图） （1）因为 FSU 和 CSU 硬件的电源控制 ）不同，请分别按照如下步骤开机： FSU 系统系统 CSU 系统系统 依次打开 “PC Microscope” 、“Scanner Power” 、 “Laser Power” 三个按钮， 将 “Laser Emission” 上的激光开关钥匙旋至“On-1 注意：显微镜控制器的开关 一般是常开 的，在打开“PC Microscope”按钮后指示灯 应该点亮，如果不亮，请打开其开关。 先按电脑主机上的电源按钮启动电脑，再打 开显微镜控制器 的开关，然后依次打开 “Scanner Power” 、 “Laser Power”两个按钮， 将“Laser Emission”上的激光开关钥匙旋至 “On-1 之后两个系统的操作一样 （2）打开荧光激发光源 （按绿色的 Power 按钮，如右图） 光源亮度调节旋钮光源亮度调节旋钮 光闸光闸 Power 按钮按钮 6 （3）电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面“LAS AF”图标启 动共聚焦操作软件。 （ 4 ）进 入 配 置 选 择 界 面 后 ， 在 “Configuration”下拉菜单中选择需要的 配置； （其中带有“simulator”字样的为模 拟方式，该方式不控制显微镜硬件，不能 拍摄图像，适合处理数据） “Microscope” 菜单中选择显微镜型号；（图中 “Resonant” 选项为快扫功能，可按需要打开或关闭， 只有配备了快扫功能的系统才会显示该 选项） ，点击“OK” ，系统继续启动。 （5）在“Initialize Stage”提示界面选择是 否初始化载物台 （如果选择 “No” ， 则 Tile scan、 Mark&Find 和 Matrix 功能不能使用） 。 注意：如果配置的是手动载物台，则不 会跳出该提示界面。 （6）系统自检完后， 进入 LAS AF 操作界面， 点击界面最上方“Configuration”按钮进入配置界面点击左边“Laser Config” 按钮打开所需激光 （OFFON） ， Argon 激光还需拖动右方滑块以调节激光输出 功率 7 2.2 软件界面简介软件界面简介 功能界面切换：参数设定（Configration） 、扫描取图（Acquire） 、图像处理（Process） 、 定量测量（Quantify） 工具和文件管理界面切换：Experiments 界面下显示当前拍摄和打开的图片， Acquisition 下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数 拍摄参数：包括图像像素 Format、扫描速度 speed、图像放大 Zoom factor、视野旋转 Rotation 等。 三维扫描工具组，用于设定和显示三维扫描的 Z 轴范围，及其他辅助设定 光路显示及设置区域， 从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置 图像显示窗口 预设光路选择按钮 激光控制栏 分光镜选择按钮 物镜选择按钮 预览按钮，可用于开始和停止预览 拍摄图像按钮 叠加图像显示按钮，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于显示所有通 道叠加后的图像 界面缩放调节滑块，左右拖动可以调节界面项目的显示比例 界面调整栏，左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围 8 2.3 在显微镜下观察样品在显微镜下观察样品 2.3.1 选择物镜： 可通过显微镜主机右侧右侧的物镜转换按钮， 或软件中的 “Objectives” 按钮进行选择（如下图） 。 （在显微镜设置软件 Leica AF Hardware Configurator 中可设定最下方的红圈中的按钮为干/油镜转换，在干/油镜之间切换时需要先按 一下此按钮才能完成转换） 2.3.2 明场观察： 将样品置于载物台上， 按显微 镜左侧左侧的TL/IL 按钮打开明场光路 （如右图）（因 显微镜所处状态不同，有时候需要按两次才能 打开） ，在明场条件下选择合适的视野。通过 调焦按钮或旋钮调节至合适的 z 轴平面，通过 显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。 如果是电动载物台，需通过遥控手轮调节 载物台的运动以选择合适的视野（如下图） 。 2.3.3 按显微镜前面板的荧光滤块选择按 钮切换至荧光观察光路 （如右图所示） ， 其 上的标注与荧光颜色的对应关系为：I3 - 绿色，N2.1-红色，A蓝色，有些配置的 显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不 同，请以实际情况为准。 再按荧光光闸按钮（SHUTTER）打开 荧光，进行样品的荧光观察。 2.3.4 观察完毕后，按显微镜前面板上的 9 “SHUTTER”按钮以保护样品 2.4 采集共聚焦图像采集共聚焦图像 2.4.1 光路设置： 调用已有的设置：选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置，激光波长及 其输出功率、分光镜、检测波长范围、检测器 gain 及 offset 都会自动设置，包含几种最常用 的荧光染料。选择某一设置后，可按样品的实 际情况对参数进行优化（如后述） ，并以新的 名称保存。 （如右图） 修改已有设置：可改变所选激光、调节激 光输出功率、改变分光镜、改变所选 PMT、调 节 PMT 检测范围、 调节 PMT 的 gain 或 offset 等。如下图。 建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、 适宜的分光镜、检测器及检测波长范围。 10 分光镜选择原则：分光镜选择原则：根据所用激光 波长来选择合适的分光镜。 1 405 激光选择 Substrate；2其 他可见波长的激光根据其波长选择分 光镜， 如 488 激光可选择 DD488/552、 TD488/552/638 分光镜。 3RT 15/85 分 光镜所有波长激光都可用，但是会损 失 85%的激光能量和 15%的荧光能量，一般在进行光谱扫描的时候选用。 Sequential Scan:若染料的发 射光谱有重叠，为减少串色，成像 时每种染料要单独激发，或者说， 每次只用一种激发光激发，并只检 测一种染料。可用 Sequential Scan 来实现。 （如右图）激活 Sequential Scan 功能， 可在下面的 Seq 中分别 设置各个染料的激发和检测光路。 2.4.2 选择扫描模式 默认模式为 xyz 扫描，是最常 用的扫描模式，可用于 xy 扫描和 z 轴层切（xyz 扫描） 。还可在下拉 菜单中选择由 x，y，z，t （时间） 以及（波长）组合而成的多维扫 描模式， 如 xzy， xyt， xy， xyzt， xyz，xyzt 等。 2.4.3 设置扫描参数 包括分辨率（format） 、扫描速 度 （speed） 、 针孔大小 （pinhole） 、 线平均（line average） 、面平均 （frame average） 、累加 （accumulation） 及放大倍数 （Zoom） 等。 （如右图） 分辨率：默认值为 512512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越 高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。 扫描速度：默认值为 400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的 速度。可选择双向扫描（Bidirectional X）来达到更高速度，这时可能需要 进行相位校准（Phase correction） 。 针孔大小：默认值为 1AU。如果增大针孔直径，可增加信号强度，但是 所获取图像的共聚焦效果会降低，光切厚度也会随之增加。 平均：用于降低背景噪音。分为线平均（Line average）和面平均（Frame average） ，可在下拉菜单中选择平均的次数。 累加：仅用于荧光非常弱的样品 11 2.4.4 预览图像 点击软件 Acquire 界面左下方的“Live”按钮以预览图像（下图） ，图像 将显示在右侧的显示屏上。 预览开始后， “Live”按钮变为“Stop” ，点击“Stop”按钮可停止预览。 注意：注意：一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应 快速操作，尽量减少预览的时间。快速操作，尽量减少预览的时间。 建议： 点击 Live 按钮之前， 可调节 format 至 512512， speed 至 600Hz 以获得较快的刷新频率。 预览应达到以下目的：预览应达到以下目的： 1找到最适合观察的焦平面； 找到最适合观察的焦平面； 2使图像亮度动 使图像亮度动 态范围达到最佳态范围达到最佳。 可通过调节控制面板的 “Z Position” 旋钮找到最适合观察的焦平面 （如 下图） ；或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮（见第 8 页图） 。 图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第 9 页图） 、Smart Gain 和 Smart Offset（见上图） 。 参数的调整原则：参数的调整原则： （1） Smart Gain 的调节： 增大则信号和噪音都增强， 减小则信号和噪音均减小。 一般情况下，Gain 值的正常范围为 5001000； （2）Smart Offset 的调节：可扣