培养基灭菌与空气净化,第一节 培养基灭菌 一、灭菌的原理和方法,消毒（disinfection）与灭菌（sterilization） 的区别？,用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。 例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。,消毒,用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。灭菌条件：121，20-30min。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。,灭菌,关于灭菌和消毒的不正确的理解是（ ） A灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细 胞、芽孢和孢子 B消毒和灭菌实质上是相同的 C接种环用灼烧法灭菌 D常用灭菌的方法有加热法、过滤法、紫外 线法、化学药品法,防腐（antisepsis）,利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （4）高渗 （2）缺氧 （5）高酸度 （3）干燥 （6）防腐剂,除菌的方法,培养基的加热灭菌 空气的过滤除菌 紫外线或电离辐射 化学药物灭菌,1.化学试剂灭菌法,甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒,2.射线灭菌法,3.干热灭菌法,电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱,常用烘箱，灭菌条件：160下保温1h 适用范围：金属或玻璃器皿,4.湿热灭菌法,利用饱和蒸汽灭菌，条件：121，30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌,5.过滤除菌法,利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气,6.火焰灭菌法,火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口,谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（ ） A高压蒸汽灭菌 B高温灭菌 C加入抗生素灭菌 D酒精灭菌,培养基的湿热灭菌,蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。,将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称实罐灭菌。,（一）间歇灭菌 （常用）,240,160,120,80,时间（min),0,50,100,150,温度,升温,冷却,保温,培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况,过程包括： 升温、保温和冷却三阶段。 各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%。,发酵罐,蒸汽,蒸汽,冷却水,无菌培养基,配料罐,泵,加热塔,维持罐,冷却管,（二）连续灭菌（又称连消）,将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行 加热、保温和冷却而进行灭菌。,连续灭菌的基本设备有哪些 ？,问题,连续灭菌的流程与设备,（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到6070 C ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声； （2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126132C ）；,（3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持10min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的； （4）冷却管，使料液冷却到4050C后（冷水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。,连续灭菌过程中温度的变化(虚线),间歇灭菌与连续灭菌的比较,空气净化（除菌） 发酵对空气无菌程度的要求 一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3。,空气除菌,空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) 含量一般为103 米。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.61m）。,104,空气除菌的方法,过滤除菌 热杀菌 试剂灭菌 辐射灭菌,无菌室、培养室、仓库,空气过滤除菌的原理与介质 过滤除菌的种类 绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。 如聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）制成的 0.3 m的微孔滤膜。 深层介质过滤：介质的孔隙一般大于微生物细胞。 如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。,深层介质过滤的原理 1、惯性冲击作用： 2、拦截滞留作用： 3、布朗扩散：1um 慢气流 不规则 直线运动 4、重力沉降：重力 气流拖带力 5、静电引力作用,深层介质过滤的原理 微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。,空气过滤除菌介质,（）纤维状或颗粒状过滤介质 棉花：有弹性，纤维长度适中（常用） 玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好。 活性炭：要求质地坚硬，颗粒均匀。 缺点：体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握，空气压降大。,（）纸类过滤介质 超细玻璃纤维纸：36张叠在一起使用，过滤效率高，压降小。 缺点：强度不大（特别是受潮后）。,发酵生产中制备无菌空气的 大致过程,空气 空压机 贮气罐 冷却 除油水 加热 空气预处理 总过滤器 分过滤器 无菌空气 空气过滤,空气过滤除菌流程,高空取气,为远离地面几十米的管子。 每升高10米，空气中杂菌降低一个数量级。因此从高空取气要比从低空取气有利得多。,粗过滤器 作用：捕集较大的灰尘颗粒，并保护空压机 要求：过滤效率高、阻力小。,前两步目的：提高压缩前空气的洁净度。,空气压缩 克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。,空气贮罐 紧接空压机安装 消除压缩机排出空气量的脉冲，维持稳定的空气压力。 利用重力沉降作用除去部分油雾。,压缩空气的冷却 压缩后空气温度显著上升，能引起过滤介质的炭化或燃烧，增大发酵罐的降温负荷，增加培养液水分的蒸发，需冷却。,压缩空气的除油除水 冷却降温后的空气湿度增大，会使过滤介质受潮失效。,旋风分离器利用离心力进行沉降，对于10m以上的微粒分离效率较高。 丝网分离器利用惯性进行拦截，分离效率较高，能除去25m的细小颗粒。,旋风分离器,采用惯性拦截等机理，有效去除空气中的水、油雾、尘埃，不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。,空气的加热 将除油水的空气加热（温差在1015C 左右），降低相对湿度（达50%60%）后，输入过滤器。,发酵生产中制备无菌空气的 大致过程,空气 空压机 贮气罐 冷却 除油水 加热 空气预处理 总过滤器 分过滤器 无菌空气 空气过滤,为什么要进行空气的预处理？ 提高压缩前空气的洁净度 去除压缩后空气中的油和水,空气过滤器 过滤除菌的关键设备,发酵车间的空气过滤器,空气净化的流程,吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤 进入空气压缩机（120150C） 冷却（2025C），除去油、水，再加热至30 35C。 最后通过总过滤器和分过滤器，获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。,180M3发酵罐车间,大型空气压缩机,发酵设备发酵罐,发酵罐的特点 轴封严密，泄漏少 能承受一定压力、温度 搅拌通风装置保证气液充分混合 具有足够的冷却面积 死角少，灭菌彻底 适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）,发酵罐的类型,搅拌釜反应器 鼓泡式反应器 气升式反应器,鼓泡式反应器 气升式反应器,发 酵 控 制 Fermentation control,实验一 产酶菌株的筛选,定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,新种分离与筛选的步骤,（一）采样,1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,从自然界筛选,2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,（二）增殖培养,为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,（三）培养分离,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,（四）筛 选,这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。,（五）毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,