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第二十章 高效液相色谱法 HPLC,第一节 概述,high performance liquid chromatography,一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点,以气相色谱理论为基础,在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,(一)HPLC与经典LC区别,主要区别:固定相差别,输液设备和检测手段,1经典LC:仅做为一种分离手段 柱内径13cm,固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相;分析周期长; 柱效低(H,n);无法在线检测,灵敏度差 2HPLC:分离和分析 柱内径26mm,固定相粒径10m(球形,匀浆装柱) 高压输送流动相;分析时间大大缩短; 柱效高(H,n);可以在线检测,灵敏度高,2019/7/11,表 20-1 HPLC法与经典LC法性能对比 经典LC HPLC 固定相 一般规格 特殊规格 固定相粒度(m) 75500 310 粒度分布(RSD) 2030 5 柱长(cm) 10100 325(分析型) 柱内径(cm) 25 0.30.46 柱入口压强(MPa) 0.0010.1 240 柱效(理论塔片数/m) 10100 31048104 样品用量(g) 110 10-610-4 分析所需时间(h) 120 0.050.5 装 置 非仪器化 仪器化,二、HPLC与GC差别,相同:兼具分离和分析功能,均可以在线检测 主要差别:分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC:能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品, 高沸点、热稳定性差、离子型等样品不可检测 占有机物的20% HPLC:溶解后能制成溶液的样品, 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛,占有机物的80%,2流动相差别 GC:流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力,只与固定相作用 HPLC:流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力,为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素,对分离起很大作用 流动相种类较多,选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC:加温操作 HPLC:室温;高压(液体粘度大,峰展宽小),三、高效液相色谱仪流程图,续前,四、HPLC的特点和应用,“三高” “一快” “一广”,高柱效n=104片/米,柱效高(远高于一般LC) 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛(可分析80%有机化合物),第二节 基本理论和条件选择,一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择,基础,一、塔板理论,二、速率理论(与GC对比),1.,2)涡流扩散项A及其影响,2.,讨论: 1)流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比),next,图示,back,续前,3)传质阻抗项及其影响,固定相传质阻抗CS:因固定液膜厚度df极小,固定相传质阻 抗CS可以忽略 流动相传质阻抗Cm: 静态流动相传质阻抗CSm:在固定相微孔内的滞留的流动相产生 的传质阻抗 传质阻抗项与流动相的粘度及柱温有关,图示,降低板高的途径有: (1)小粒度(dp小)、均匀的球形化学键合相 (A、C小),匀浆法装柱 (2)低粘度流动相(C小),如甲醇(乙醇与甲醇的理 化性质相似却无毒, 但25时粘度是甲醇的2倍) (3)流速不宜过快(1ml/min),(Cu小) (4)增加柱长L,可增加n,但同时也增加tR, 增加分析时间,一般不可取的。 (5)柱温适当,如室温25左右,第三节 各类高效液相色谱法,HPLC法分类: 按固定相聚集状态:液-液色谱法(LLC) 液-固色谱法(LSC) 按分离机理:分配色谱法(partition chromatography) 吸附色谱法(adsorption chromatography) 离子交换色谱法(IEC) 空间排阻色谱法(SEC) 化学键合相色谱法(BPC) 亲和色谱法(AC) 胶束色谱法(MC) 手性色谱法(CC),基本类型色谱法,一、液固吸附色谱法(LSC) liquid-solid adsorption chromatography 流动相为液体,固定相为固体吸附剂,1分离机制:利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异,分离前提:K不等或k不等,2019/7/11,2. 影响容量因子k的因素,在色谱柱一定(S与Vm一定)及柱温一定时,k与溶质、溶剂的性质有关。在吸附色谱法中,硅胶是最常用的吸附剂,故以硅胶为例讨论 硅胶与溶质分子的亲合力顺序(容量因子序): 饱和烃芳烃有机卤化物醚酯醛酮醇胺羧酸 与硅胶亲合力大的溶质,k大,tR(或tR)大,晚出柱 流动相的极性 常用流动相以烷烃为底剂,加入适当极性调整剂组成二元或多元溶剂系统 流动相系统极性越大,洗脱力越强,容量因子越小,tR越小。 调整溶剂的极性,可以控制组分的保留时间。,续前,(3)固定相硅胶的活性,5. 其他固定相:高分子多孔小球:YSG 原理:吸附+分配 特点:柱选择性好,峰形好,柱效低 适用:分离弱极性化合物,3. 适用:分离极性化合物,硅胶吸水量,LSCLLC 硅胶含水量较小,吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量17%,硅胶失活载体,吸附的水固定液, 分配色谱,4出柱顺序: 硅胶极性较大,强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱,二、液液分配色谱法(LLC),1分离机制:利用组分在两相中溶解度的差异 2固定相:载体+固定液(物理或机械涂渍法) 缺点:系统内部压力大,易流失,不实用 3正相色谱固定液极性 流动相极性(NLLC) 极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 4. 反相色谱固定液极性 流动相极性(RLLC) 极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分,三、化学键合相色谱法(BPC),(一)化学键合相 (二)反相键合相色谱 (reversed bonded phase chromatography, RBPC) (三)正相键合相色谱 (normal bonded phase chromatography, NBPC) (四)离子对色谱 (五)离子抑制色谱(了解),(一)化学键合相,定义:利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面, 而构成化学键合相,1分离机制:分配 + 吸附(以LLC为基础) 2特点: 1)不易流失 2)热稳定性好 3)化学性能好, pH介于28范围内溶液中不变质 4)载样量大 5)适于梯度洗脱 6)应用范围广(正相、反相、离子对色谱等),(二)反相键合相色谱法,1、分离机理:疏溶剂理论为代表,溶质的保留机理是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力,促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。,2、影响因素 溶质分子中非极性部分的总表面积,k ,tR 键合相中烃基的总表面积 ,k ,tR 洗脱液表面张力(含水量) ,k ,tR ,3.反相色谱中影响溶质保留的因素: (1)反相键合的烃基链长;(2)有机溶剂的比例; (3)流动相的pH; (4)流动相的盐浓度。,续前,4流动相极性与k的关系: 流动相极性,洗脱能力,k,组分tR 5出柱顺序:极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6适用:非极性中等极性组分(HPLC80%问题),(三)正相键合相色谱法,1、固定相:极性键合相 如氰基(CN)、氨基(NH2)键合硅胶。 (经典:水饱和的硅胶) 2、流动相:类似与以硅胶为固定相的吸附色谱法 非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 如烷烃加醇类。(与水不混溶的溶剂) 3、分离机制:溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力,续前,4流动相极性与k的关系: 流动相极性,洗脱能力,组分tR,k 5出柱顺序:结构相近组分,极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱 6适用: 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似(极性稍小) 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大,碱性 分析极性大物质、糖类等,(四)反相离子对色谱法(IPC或PIC),反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂,使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对,增加k和tR,以改善分离 模型,1)离子对试剂:烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸 2)影响k的因素 离子对试剂的种类:碳链长度增加,溶质的k增大; 流动相的pH:有利于组分和离子对试剂离子化时(离子对的形成),组分的k值最大 固定相 、流动相性质(同一般RP-HPLC)。 3)适用:较强的有机酸、碱,反相离子对色谱法模型,3,3,+,+,(,),+,3,s,3,(,+,固定相:弱极性,+,(,),+,B,),+,流动相:极性,通式,(五)反相离子抑制色谱,在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相pH值,抑制 组分解离,增加其k和tR,以达到改善分离的目的,1)离子抑制剂:弱酸、弱碱性物质或pH一定的缓冲溶液 2)k的影响因素: 选择流动相:应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR,k 碱性物质加入碱NH3H2O tR,k 调节pH范围:3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子 3)适用:弱酸、弱碱物质 pH=37弱酸;pH=78弱碱;两性化合物,第四节 固定相,一、固定相要求:颗粒细、均匀、球形、耐高压 1. 液-固色谱固定相 硅胶:薄壳型;无定形全多孔硅胶(YWG); 球形全多孔硅胶( YQG) 2. 化学键合相:利用化学反应将固定液的官能团键合在载体 表面,而构成化学键合相 非极性键合相:十八烷基键合相(ODS或C18)是最常用 的非极性键合相。 中等极性键合相 极性键合相,正相色谱,反相色谱,吸附色谱,2019/7/11,第五节 流动相(溶剂系统),对流动相的要求: 与固定相不发生化学反应。 pH介于28范围内。 对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内(可用范围)或25(最佳范围), k小,tR小; k大,tR大,峰宽变大; 与检测器相适应。例如用紫外检测器时,选用截止波长小于检测波长的溶剂。 纯度高,粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压,提高柱效。,(一)流动相对分离的影响(分离方程式),(二)流动相的极性和选择性 流动相的极性(强度) 正相色谱:溶剂极性越强,洗脱能力越强 反相色谱:极性弱的溶剂洗脱能力强 流动相的选择性 不同种类的溶剂,分子间的作用力不同,故选择性不同,吸附色谱:同经典LC,二元或三元的有机溶剂,粘度小 正相色谱:同吸附色谱法 反相色谱:水-有机溶剂,粘度小,无UV吸收 常用水-甲醇或水-乙腈,续前,(三)洗脱方式,1)等度洗脱(恒组成溶剂洗脱)类似GC的等温度洗脱 以固定配比的溶剂系统洗脱组分(一个泵) 具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。 对于成分复杂的样品,往往不能兼顾某些性质相差很大组分的分离要求 2)梯度洗脱:类似GC的程序升温 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例,即不断改变其极性(两个泵) 。 适于分析极性差别较大的复杂组分,缩短分析周期;提高分离效果;改善峰形;增加检测灵敏度 有时引起基线漂移、重复性较差,2019/7/11,峰的鉴别:1苯; 2氯苯; 3对二氯苯 41,2,3三氯苯; 51,3,5三氯
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