第二编 纯化方法第二章 沉淀法,基本原理与沉淀类型一、基本原理二、制备蛋白质三、制备核酸,一 基本原理,沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子的原理是根据物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从抽提液中分离有效成份的目的。 蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面有明显差异，所以制备这两种大分子时，所用的试剂和操作方法也不完全相同。,几种主要沉淀方法比较,(一). 盐 析 法,1 盐析原理 2 盐分级沉淀 3 盐析曲线制作 4 盐析的影响因子 5 脱盐,二.蛋白质的沉淀分离,1.盐析的原理 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。,原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。不同蛋白质因所带电荷和水化程度不同，而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。 如血清中加入50%饱和度的(NH4)2SO4可使球蛋白析出，加入100%饱和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，达到分级分离的目的,2 盐分级沉淀 盐的选择: 一般选择硫酸铵,缺点: 缓冲能力差 需要脱盐,优点: 溶解度大(769g/L，25) 对温度不敏感（679g/L,0 ）. 分级效果好 稳定蛋白质结构的作用 性格低廉,（2）硫酸铵盐析 a.饱和溶液法 b.固体法 c.透析法,通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在80%硫酸銨飽和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。,a 加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V= V0(S2-S1)/（1-S2） V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至5060，趁热滤去沉淀，再在0或室温平衡12天，有固体析出时达100饱和度。,b加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 g=533(S2-S1)/（100-0.3S2） S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；g：将1L S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数； 实际使用时，g可直接查表得到。（注意：0，25两张表，室温用25）,调整硫酸铵溶液饱和度计算表(25度),3 盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。,蛋白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度,4 盐析的影响因子 (1) 盐析常数 ks ks表示有效成分溶解度降低的速率与盐浓度之关系，ks值大 ，说明溶解度降低的速度随盐浓度的增加而快速降低。对一种成分而言， ks值越大，其分级范围就窄，盐析效果就好。它与蛋白质本身的性质、溶液的pH、温度、盐的种类等有关。 (2)盐分级范围的差异性 当分离两种以上蛋白质时，每种ks值都很大，而且 盐析范围差异明显，则分离效果好； ks值大，盐析范围差异小，分离效果不好。,（3）蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在0.2-2%。 （4）离子强度和离子类型的影响 a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来 c.离子强度相同时，高价离子，半径小的离子盐析力强,（5）pH的影响 有效成分的溶解度与pH有密切关系。如甘油醛脱氢酶（PI=8.5）在pH6.0时能溶于3.2M/L硫酸铵溶液，当调pH到7时，立刻产生沉淀。 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。 一般来说，第一次盐析（除去杂质），pH应调离有效成分的pI靠近杂质的pI；而第二次盐析时（沉淀有效成分）时，pH应调到有效成分的pI。,（6）温度的影响 在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。 一般在室温下进行盐析;温度敏感的蛋白质在低温4进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25比0时溶解度低，更容易盐析。 实际使用： 制备初期：pH ，温度一定，改变盐浓度（离子强度）（Ks分段盐析）； 纯化，结晶：离子强度一定，改变pH，温度（分段盐析）,透析： 透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。 原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。,5 脱盐,(1) 透析法 (2) 凝胶过滤法,a.透析袋的处理（除去金属离子和水解酶） 在含1mmol/L EDTA的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10分钟，用镊子取出，经蒸馏水煮沸，漂洗可用，老化后容易破裂。 b.透析液选择 低离子强度的中性缓冲液，适量酶的保护剂，防止微生物生长的0.02%叠氮钠(NaN3) c.掌握透析时间 体积比（：），搅拌与否 检查：硫酸铵氯化钡（10%） 氯化钠硝酸银（10%）,（二）有机溶剂沉淀法1、基本原理：降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 破坏大分子周围水膜，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。2、常用试剂：甲醇、乙醇、丙酮 用量计算：与盐析饱和溶液法相同,注意：（1) 低温操作（2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。 （3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，即与等电点共沉淀结合使用。（4) 注意离子强度，离子种类的影响。,3、优点： 比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。4、缺点： 有机溶剂易使蛋白质和酶变性，必须预冷，操作要在冰盐浴中进行。 中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加0.05mol/L的中性盐。 由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。,（三）选择性变性沉淀法： 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。 例如：利用加热，改变pH或加进某些重金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解。,（四）等电沉淀法： 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。,（五）非离子多聚物沉淀法： 聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。 沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率。 优点：（1）操作条件温和，不易引起变性； （2）具有极高的沉淀效率； （3）沉淀后多聚物容易除去。应用：沉淀分离细菌，病毒蛋白；质粒纯化,核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。 从生物材料中分离出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在 。因此，要制备初步纯化的核酸时，首先要分离出DNP或RNP，再将复合物解聚，除去蛋白质，然后通过沉淀法得到核酸。 在0.14mol/L的氯化钠溶液中， RNP 的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1%；当氯化钠的浓度达到1mol/L的时候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。DNP,DNP,三、核酸的提取与沉淀分离,1.DNP/RNP复合物的解聚： 主要采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现。 去污剂：在破碎细胞的溶液中，加入适量的阴离子去污剂SDS、Triton X-100、Tween 40 和 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将DNP/RNP复合物解聚，进而释放出核酸。去污剂-蛋白质等复合物可用适量乙酸钾沉淀去除。 有机溶剂：苯酚、氯仿等是蛋白质的变性剂。根据抽提液中蛋白质的含量和溶剂的纯度，用变性剂反复处理抽提液，直到离心后，上层水相（含核酸）和下层有机相之间的界面处无变性蛋白为止。蛋白水解酶：用此法除去复合物中的蛋白质的操作比较温和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶K和蛋白酶E，可以避免剪切和破坏核酸。,应注意： A、核酸溶液中含高浓度盐类或多糖类物质时，水相和有机相位置会颠倒。 B、要通过适当的振荡或旋转来使有机溶剂起作用。核酸分子越大，应越温和。 C、苯酚应经过处理。（Tris-酚） D、苯酚/氯仿/异戊醇（24/24/1） E、最后用乙醚除去苯酚、氯仿。,