1-1 DNA重组技术的基本工具和基本操作程序,专题1 基因工程,一 基因工程的基本内容,主要内容,（一）基因工程的概念 （二）基因工程的基本工具 （三）基因工程的基本操作程序 （四）基因工程的应用,基因工程的概念,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,复习,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切, 拼接, 导入, 表达,实质,基因重组,复习,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接 导入,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),复习,基因工程的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与运载体DNA连接,关键步骤三：,抗虫基因导入受体(棉花)细胞,复习,解决基因工程关键步骤需要的工具,关键步骤一的工具： 关键步骤二的工具： 关键步骤三的工具：,限制性内切酶,DNA连接酶,运载体,复习,基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）,限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。 特点：特异性。 即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,复习,识别序列,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 也有少数限制酶识别序列由4、5、或8个核苷酸组成。,迄今为止，有300多种微生物中分离出4000种限制酶,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制酶,限制酶,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,平末端,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,提问,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,2、基因的针线DNA连接酶,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,E.coliDNA连接酶,从大肠杆菌中分离得到的。只能用于粘性末端的连接,T4DNA连接酶,从T4噬菌体中分离得到的。既能用于粘性末端的连接，又能用于平末端的连接，但是平末端的连接效率低。,为什么要用运载体？,1、直接将目的基因连接到受体细胞的DNA上不能表达。 2、只有利用某种能够侵染受体细胞，并且在受体细胞中能够复制和表达的载体来用于表达。,作为运载体必须具备哪些条件,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,常用的运载体主要有两类：,1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒,质粒：,质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。 质粒是基因工程最常用的运载体。 绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,四个基本步骤：,三、基因工程的基本操作程序,1）提取目的基因 2）目的基因与运载体结合 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和表达,目的基因,目的基因是人们所需要转移或改造的基因。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,1、目的基因的获取,1目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,概念：基因文库 （gene library）,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library),基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,基因组文库与部分基因文库的关系,cDNA文库的构建,反转录法：,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。,利用PCR技术扩增目的基因,PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,DNA序列自动测序仪： PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。, 人工合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,3、基因表达载体（重组质粒）的构建,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。 （2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1过程:,2基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,条件,步骤二：目的基因与运载体重组,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同一种,过程:,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,目的基因与运载体结合,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞,1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,步骤四：目的基因的检测和表达,(四)目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,知识延伸DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。,返 回,DNA,附着在膜上,硝化纤维素,加探针,报告基因（含荧光素分子）,变性,DNA杂交 （如检测SARS病毒等）,a,b,c,d,复习题,1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?(试举例说明),2）简述农杆菌转化法,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的