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质粒(plasmid),噬菌体或病毒DNA,考斯质粒(cosmid)与噬菌粒,人造染色体载体,载体的功能及特征,载体的功能及特征,载体的功能(P12),为外源基因提供进入受体细胞的转移能力,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因提供在受体细胞中 扩增和表达能力,注意:上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备,载体的功能及特征,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性),具有合适的筛选标记,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,2.1.1质粒载体,2.1.1.1质粒的基本特征,定义:质粒是一类存在于原核细菌和真菌细胞中,能独立于寄主染色体而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子并被稳定遗传的一类核酸分子。是处于生命与非生命的分界线上。,(1)质粒常见于原核细菌和真菌中;,(2)绝大多数的质粒是DNA型的,绝大多数的天然DNA质粒具有共价封闭、环状的分子结构,即cccDNA;,(3)质粒DNA的分子量范围:1 - 100 kb,质粒的基本特征,1.质粒的自主复制性:,质粒能摆脱寄主细胞的DNA复制系统的束缚进行自主复制;,质粒DNA上含有自己的复制起始区(ori),形成独立的复制子结构,根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为两大复制,类型:,严紧型复制控制的质粒 1 - 5拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 30 - 50 拷贝 relaxed plasmid,质粒的基本特征,2.质粒的可转移性:,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类:,接合型质粒:能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个,细胞(接合作用),如F、Col、R质粒等;,非接合型质粒:不能在天然条件下独立地发生接合作用。,值得注意的是,某些非接合型质粒(ColE1)在接合型质粒的存在,和协助下,也能发生DNA转移,这个过程由bom和mob基因决定。,质粒的基本特征,3.质粒的不相容性:,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个,细胞中,这种现象称为质粒的不相容性,不相容性的质粒组成不,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构,彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构,彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构,彼此不相容,相容性群。以大肠杆菌的质粒为例:,质粒的基本特征,4.携带特殊的遗传标记:,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,包括:,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,2.1.1.2质粒的构建,原因:天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷,不能满足克隆载体的要求,因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大,多是由少数几个野生型质粒构建而成的:,pSC101 8.8 kb,拷贝数 5,四环素抗性标记基因 Tcr,ColE1 6.5 kb,拷贝数 20 - 30,大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124 ColE1衍生质粒,氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,改造的原则,(1)删除不必要的DNA区域,尽量缩小质粒的相对分子质量 (2)灭活某些质粒的编码基因,应为非转移性质粒,应为松弛型质粒 (3)加入易于识别的选择标记基因 (4)引入具有多种限制性内切酶的单一识别位点 (5)根据外源基因克隆的不同要求,加装特殊的基因表达调控元件,构建过程(P14),2.1.1.3质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类:,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因,拷贝数1000-3000,扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101,拷贝数小于10,表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头(polylinker),整合质粒 装有整合促进基因及位点,便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子,便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因,便于启动子等元件的克隆筛选,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322:,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,pUC18 / 19:,拷贝数 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点(MCS),正选择颜色标记 lacZ,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18 / 19:正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z:,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点(MCS),正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意:T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3E,PSP6,酶所识别,因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶,如:,E.coli BL21(DE3)等,2.1.1.4质粒DNA的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA:,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,氯化铯密度梯度离心法:,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体;,加溶菌酶裂解细菌细胞壁;,加CsCl和溴乙锭;,超速离心过夜;,在紫外灯下吸取cccDNA;,稀释沉淀cccDNA。,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,碱溶法:,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体;,加溶菌酶裂解细菌细胞壁;,加NaOH和SDS的混合溶液,破膜释放内含物;,加高浓度的醋酸钾溶液,沉淀染色体,去除染,色体DNA及大部分蛋白质;,离心取上清液,用苯酚-氯仿萃取,去除痕量的蛋白质;,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA;,用无DNase的RNase去除残余的RNA。,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,沸水浴法:,用含有EDTA和Triton X-100的,加溶菌酶裂解细菌细胞壁;,沸水浴40秒钟;,离心,用无菌牙签挑去沉淀物;,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。,缓冲液悬浮菌体;,另一类载体 噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物,能高效率高特异性地侵染宿主,细胞,然后或自主复制繁殖,或整合入宿主基因组中潜伏起来,而且在,一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的,有用载体,因为:,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞;,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。,2.1.3.1l 噬菌体的生物学特性:,生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61?个基因,2.1.2l双链噬菌体DNA载体,l 噬菌体生物学特性: 生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l - DNA,l 噬菌体生物学特性: 感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,l 噬菌体生物学特性: 感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75 - 105%,即 36 - 51 kb,D,A,l 噬菌体生物学特性: 溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后,除能裂解细胞外,也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上,并不产生子代噬菌体颗粒,这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活,而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质,使噬菌体或处于溶菌状态,或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶原状态,l-DNA重组分子的体外包装:,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒,方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取,现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分:一部分缺少E组份,另一部分则缺少D组份。包装时,当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后,包装才能有效进行,任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后,均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒,这也是基于安全而设计的。,2.1.2.2l-DNA载体的构建:缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb,本身长度为48.5kb,只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时,才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度,可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少,可将l-DNA分成两大类载体:,插入型载体,取代型载体,取代型 (Replacement vectors) 这种载体具有两个对应的酶切克隆位点,在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列,可以被外源插入的DNA取代。 如Charon 4 载体:克隆能力大,2025kb,插入型 (Insertion vectors ) 这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 如:gt10 、 gt11 克隆能力小,一般不到10kb,2.1.2.3 l-DNA载体的主要类型:,2.1.2.4 l-DNA及其重组分子的分离纯化:P22,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液,37培养1小时,用新鲜培养基稀释,继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒,密度已达1013 -1014 / L,大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心,沉淀噬菌体,苯酚抽提,释放l-DNA,乙醇或异丙醇沉淀l-DNA,l-DNA作为载体的优点:,l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒,能高效转染大肠杆菌,l-DNA载体的装载能力为25 kb,远远大于质粒的装载量,重组l-DNA分子的筛选较为方便,重组l-DNA分子的提取较为简便,l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段,但不适合表达,外源基因,2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体,2.1.3.1M13噬菌体的生物学特性: 生物结构,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有10个基因,2700个VIII,M13 噬菌体不裂解宿主细胞,但抑制其生长,III,VI,VII,XI,M13 DNA“+”链进入雄性大肠杆菌合成“-”链 产生双链M
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