临床十二大班 9人组,2012级本科分子生物学实验设计,案例,患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。,案例分析,1、恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，脸色苍白， 皮肤及巩膜黄染（伴有溶血性黄疸） 2、心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常（症状不严重）,案例分析,3、血象 红细胞 1.981012/L（）4.05.51012/L 血红蛋白53g/L（） （110-150G/L ） 血清总胆红素85.5mol/L（）1.71-17.1mol/L 4、尿常规 尿液下未见红细胞（红细胞膜已不完整） 尿胆素原呈阳性,轻度 蚕豆病 并伴溶血性黄疸,根据以上信息和检查诊断,蚕豆病简介,蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。 多见于儿童，男性患者约占90%以上。,临床表现,早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于12日内死亡。,红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定（紫外法）,设计实验进一步明确诊断,实验原理,要检测G6PD的活性，可以检测NADPH生成量,实验原理,已知：NADPH在340nm的紫外线照射下产生荧光 即可以每隔2分钟在340nm波长下测定孵育液中NADPH吸光度 以10min吸光度值的变化（A340）计算NADPH的产量。,实验原理,还原型谷胱甘肽使高铁血红蛋白还原为血红蛋白,2G-SH,MHb Hb,G-S-S-G,NADP+ NADPH,即可以检测血红蛋白的含量,实验器材和试剂,1.实验器材 恒温水循环紫外分光光度计，可见分光光度计，离心机。 2.试剂 （1）0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（pH8.0）：称取Tris12.1g,MgCl26H2O 4.06g,加入160mL蒸馏水溶解，用HCl调pH至8.0，然后加入蒸馏水至200mL。 （2）2 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)：称取NADP 21.3mg，溶于10mL蒸馏水中。4 可保存20天左右。,（3）6mmol/L葡萄糖6磷酸二钠(G6PNa2)：称取21.5mg G6PNa22H2O，溶于10mL蒸馏水中。4 可保存20天左右。 （4）溶血剂：取巯基乙醇0.1mL，10% EDTA 2.0mL，6mmol/L NADP 0.4mL，加蒸馏水至总体积200mL。 （5）血红蛋白氧化剂（Drabkin试剂）：称取K3Fe(CN)6 0.2g，KCN 0.052g，NaHCO3 1.0g，加蒸馏水至1000mL，置棕色瓶内避光保存，可保存20天。 （6）0.9% NaCl，ACD抗凝剂。,实验器材和试剂,实验操作流程,1、洗涤红细胞 取静脉血2.0mL，放入含0.4mLACD抗凝剂的试管中，混匀。吸取0.2mL抗凝血放入试管中，加入4mL预冷的生理盐水，轻轻摇匀，2500r/min离心5min,倾去上清，重复三次。 2、溶血液的制备 向红细胞沉淀中加入溶血剂2.0mL，震荡1min，4放置10min以上。,3、NADPH的测定 取石英比色杯两只，标为“测定”及“空白”，按下表操作：,试剂,体积,蒸馏水（uL） 0.5mol/L Tris-HCl MgCl2缓冲溶液（uL） 6mmol/L G6P-Na2 (uL) 2mmol/L NADP+ (uL),2040 300 300 300,混匀后放入带恒温水循环（25）的紫外分光 光度计中，预热10min 然后在“测定”中加入溶血液60uL,“空白”中加入溶血剂60uL，混匀,以“空白”调“0”,1min后开始测340nm吸光度（A340），每2min纪录吸光度一次，至10min止，比较每2minA值的变化情况，若相近则表明酶促反应平稳。以10minA值的变化（A340）计算NADPH的产量。,4.溶血液中血红蛋白含量的测定 取试管一支，按下表操作：,试剂,体积,Drabkin(mL) 溶血液(mL),0.3 3.0,混匀，室温放置15min，以Drabkin试剂调零，读取540nm的吸光度（A540）。,注意事项,1.洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。 2.测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。,结果分析,1.NADPH产量的计算 NADPH在340nm处，其每微摩尔的吸光系数（）为6.220，故10min内NADPH的产量计算公式为： NADPH产量（mol） = 2.血红蛋白含量的计算 血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在540nm处，其毫摩尔吸光细数（）为44，故溶血液中血红蛋白的含量计算公式为： 血红蛋白含量（mmol）=,3.G6PD比活性（U/g Hb）的计算 G6PD比活性单位（U/g Hb） = =,【参考范围】正常值：大于2.8U/gHb,从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果,生化角度,实验室检查,结果导致,红细胞膜的破坏 胆色素代谢异常,G6PD,磷酸戊糖途径,NADPH,磷酸戊糖,维持谷胱甘肽的还原性,核酸生物合成原料,红细胞膜的破坏,谷胱甘肽阻止氧化血红蛋白，从而保护红细胞膜的完整性，如若缺乏，此时的红细胞易于破裂 。,NADPH高铁血红蛋白还原酶,GSH,MHb,Hb,红细胞膜的破坏,胆红素,铁卟啉类化合物的降解产物 80%以上来自衰老红细胞破坏所释放的血红蛋白的分解 自由通过生物膜产生毒性作用,G6PD缺乏,NADPH严重缺乏,谷胱甘肽难以保持还原状态,NADPH高铁血红蛋白还原酶活性低,红细胞膜完整性破坏,红细胞裂解,血红蛋白大量溢出,胆红素生成量增加,Hb大量氧化成MHb，Hb含量减少,具体分析,皮肤及粘膜黄染 血清总胆红素超过17mol/L即为高胆红素血，一般若在1734mol/L，临床无明显黄疸，为隐性黄疸，超过34mol/L则可见皮肤、粘膜黄染。 血尿 急性溶血时大量红细胞被破坏，其成分从尿液中排除故出现血尿。,具体分析,体温升高 大量溶血，即血红细胞大量破坏，大量的无菌性坏死物质入血，机体动员白细胞吞噬吸收坏死物质，导致无菌性炎症，可引起发热，亦称为吸收热。 呼吸加快及心律升高 由于急性溶血导致循环血量减少，红细胞减少， 血红蛋白减少，氧气供应相对不足，故机体通过加快呼吸频率，以及加快心率维持心输出量的相对稳定以维持机体代谢的供氧。,患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）,患者体型瘦小与该病症有关,蚕豆病是因为体内缺乏G6PD， G6PD主要影响体内的磷酸戊糖途径 该途径主要生成两种重要的物质即5-磷酸核糖和NADPH,5-磷酸核糖影响：,1：核酸的合成 2：体内己糖和戊糖的代谢 3：37碳原子糖类物质的相互转化,G6PD,NADPH影响：,1：体内以NADPH作为供氢体合成多种活性物质如胆固醇 脂肪酸 和一些非必需氨基酸 2： NADPH可作为羟化酶的辅酶，参与体内生物转化作用 3： NADPH参与吞噬细胞的杀菌作用 4：维持GSH的正常水平 GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化 使蛋白质或酶处于活性状态,磷酸戊糖途径中生成多余的核糖转变为6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径，G6PD缺乏使得糖代谢受到影响。脂酸可以合成甘油三酯，其主要功能是储存和氧化能量，机体难以合成甘油三酯则消耗原有储备的甘油三酯，使得机体消瘦。同时体内的一些生物活性物质功能发生障碍，如胆固醇不能直接氧化但能转化为胆汁酸、类固醇激素 、维生素D3，参与物质代谢调节，胆汁酸具有促进脂类消化和吸收的作用；维生素D3主要参与体内血钙和血磷的调节。生物转化作用可以对体内大部分非营养物质进行代谢转化，或使有毒物质的毒性减低或消除，增强这些非营养物质的水溶性和极性，从而易于从胆汁或尿液中排除。 GSH可以保护体内蛋白质或酶免遭氧化 使蛋白质或酶处于活性状态，蛋白质一方面可以作为营养物质提供能量一方面又发挥着其它重要的生物功能，而酶使得生物体内的化学反应有条不紊的进行。,综上所述： 蚕豆病使得该男孩体内发生糖，蛋白质，脂类物质的代谢障碍，一些重要的生物活动受到影响，加之因疾病带来的一些身体上和精神上的折磨，这些因素使得他的身体比同龄孩子削瘦。,谢谢！,