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分子生物学技术 在医学研究中的应用,(基因表达),基因表达,基因表达指基因组中某基因在细胞中 转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。,基因表达的改变预示着细胞在分子水平 上的变化。它往往是细胞形态功能变化之 前的变化。,影响基因表达的因素:,1、遗传因素 个体差异,终生不变。,2、环境因素 激素、药物,细胞因子、机械刺激、 病原体感染、电刺激、细胞转化,研究基因表达的手段,1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质) 4、免疫组化 (蛋白质),原位杂交、点杂交、RNA酶保护试验 基因芯片,1、RT-PCR,基本原理: 将细胞中mRNA逆转录为cDNA,以cDNA 为模板,进行PCR反应。根据PCR产物的 量,判断基因表达的强度。,RT-PCR是一种半定量方法,实验操作:,1)RNA提取:Trizol 试剂盒。 防止RNA降解,RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。,2)逆转录: RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物(随机引物,Oligo dT),3) PCR,特异性引物、模板、Taq 聚合酶。,通过PCR,将目的片段扩增几十百万倍。 在一定范围内和一定的条件下,PCR的产物量 与模板量呈正比关系。,模板量,4)几个注意问题:,反应平台 内参 1、PCR效率差异,重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段长度 5、mRNA丰度,目标片段与内参片段,iNOS (诱导型一氧化氮合酶) GAPDH (磷酸甘油醛脱氢酶),5) PCR产物量的测定,应用图象分析软件进行密度测定。,100%,160%,A B C D,2.0 2.0,2.0 1.0,2.0 2.0,1.0 1.0,RT-PCR特点:,优点: 灵敏度高、特异性高、操作简便。,缺点: 可靠性差、不能细胞定位。,2、Northern blot,标记探针与膜固相RNA杂交。 根据杂交信号强弱判断表达量, 根据杂交信号位置判断分子长度。,杂交信号,实验操作:,1)RNA提取 2)RNA电泳(分离不同长度RNA) 3)转膜 (形成固相RNA) 4)探针标记(同位素/非同位素) 5)预杂交,杂交 6)洗膜 7)显影(放射性/酶促),Northern blot 特点:,因为没有扩增过程,Northern blot 的结果可靠性高。 可以确定未知基因的转录产物(mRNA)长度。,优点:,缺点: 1、操作烦琐 2、同位素 3、灵敏度低 4、对RNA质量要求高 5、不能定位细胞,3、Western blot,标记抗体与膜固相蛋白作用。 根据信号强弱判断蛋白表达强度。 根据信号位置判断蛋白分子量。,标准分子量 蛋白,特异性反应带,1)蛋白提取 2)蛋白电泳(分离不同分子量蛋白) 3)转移 4)封闭 5)一抗作用 6)标记二抗(HRP/AP标记)作用 7)显色,实验操作:,Western blot 特点:,优点: 直接检测蛋白质的表达量。,缺点: 灵敏度低 一抗制备难度大,购买价格高 容易出现交叉反应 不能细胞定位,4、免疫组化,标记抗体与组织细胞作用。 根据信号强弱判断表达强度, 根据信号位置判断表达细胞。,eNOS表达,(对照),(实验),实验操作,1)组织切片(石蜡/冰冻) 2)封闭,内源性过氧化物酶失活 3)一抗作用 4)二抗(HRP标记)作用 5)显色 6)复染,封片,免疫组化特点:,优点: 细胞定位,缺点: 定量不准确,人为因素干扰大 (图象分析系统),5、基因芯片,特定载体上密集的大量探针与荧光标记 的样品反杂交。 根据杂交信号强弱判断基因表达强度。,基因芯片特点:,优点: 一次杂交可以得到大量表达信息。通用 性好。,缺点: 成本高,需要专门设备。,人类基因组计划揭示了人类有34 万个基因,转录本多达10万个。基因不 同时空表达是细胞结构和功能的基础; 是组织、器官和系统发育和分化的基础; 也是大多数细胞病变的基础。了解不同 状态下的基因表达调节机制是后基因组 时代的主要任务,是探索生命本质的重 要环节。,结束语,谢谢,
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