1反相高效液相色谱法测定夏枯草中两种三萜酸的含量【关键词】 夏枯草；,乌索酸；,齐墩果酸；,反相高效液相色谱法摘要：目的建立同时测定夏枯草中乌索酸及齐墩果酸含量的方法。方法采用反相高效液相色谱法。色谱柱为 Nucleodur C18 柱(4.6 mm250 mm，5 m)，流动相为甲醇:水（8614） ，流速为 0.8 ml/min，检测波长为 210 nm，柱温 25 。结果乌索酸进样量在 0.425 2 3.826 8 g ，齐墩果酸进样量在 0.127 2 1.144 8 g 范围内，线性关系良好，乌索酸、齐墩果酸的加样平均回收率分别为 98.0 %和 98.7 %，RSD 分别为 1.0 %和 1.4 %。结论方法简单准确，重现性好，适用于夏枯草药材的质量控制。关键词：夏枯草； 乌索酸； 齐墩果酸； 反相高效液相色谱法Determination of Two Triterpene Acids in Prunella vulgaris L. by RP-HPLC Abstract：ObjectiveTo develop a new method for simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris LMethodsThe high performance liquid chromatography was usedThe column was Nucleodur C18 (4.6 mm250 mm，5 m) column，the mobile phase consisted of methanol - water (8614) , the flow rate was 0.8 ml/min and the detection wavelength was set at 210 nm. ResultsThe linear range with good linearity of ursolic acid was between 0.425 2 3.826 8 g and with the oleanolic acid was between 0.127 2 1.144 8 gThe average recovery of ursolic acid was 98.0 % with relative standard deviation (RSD )of 1.0 % and the oleanolic acid was 98.7 % with RSD of 1.4 %.ConclusionThe method is simple, accurate, reliable and can be used for quality control of Prunella vulgaris LKey words：Prunella vulgaris L; Ursolic acid; Oleanolic acid; RP-HPLC夏枯草 Prunella vulgaris L.是唇形科夏枯草属植物，为中医临床常用中药，始载于神农本草经 ，主产于河南、安徽、江苏、浙江等地，以干燥果穗或全草入药，味辛苦、性寒，具有清肝、明目、散结、消肿、止痛之功效，用于目赤肿痛、羞明流泪、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛等1 。现代临床多用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、高血压病、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎等疾病。夏枯草中含有三萜及其苷类、苯丙素类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素类、有机酸类、挥发油等多种活性化学成分 24 ，其中乌索酸和齐墩果酸为夏枯草的主要活性成分56 。目前夏枯草中两种三萜酸含量的测定，文献报道主要采用薄层色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法和毛细管胶束电动色谱法710 。本实验建立高效液相色谱法同时测定了夏枯草中乌索酸和齐墩果2酸的含量，旨在为控制夏枯草内在质量提供依据。1 仪器与材料 1.1 仪器 Waters515 高效液相色谱仪，2296 光电二极管矩阵检测器，7725I进样阀，Empower 中文色谱工作站；KS-1500 超声清洗器（宁波科声仪器厂） ，CP225D 准微量天平（德国 Sartorius 公司） ，UPWS-I-10T 纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂） ，FW100 高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司） 。1.2 试剂与材料 甲醇为色谱纯（上海陆忠试剂厂） ，水为高纯水，乙醇为分析纯（95 %，江西同盟试剂厂） ，乌索酸、齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号分别为：110742-200314，110709-200311） ，夏枯草（市售） 。2 方法与结果 2.1 色谱条件和系统适应性色谱柱为 Nucleodur C18 柱(4.6 mm250 mm，5 m)，带保护柱，流动相为甲醇-水（86:14） ，流速为 0.8 ml/min，检测波长210 nm，柱温 25，外标法定量分析，乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于 10 000。对照品及夏枯草样品的 HPLC 色谱见图 1。a 对照品 b 夏枯草样品 1.齐墩果酸 2.乌索酸图 1 对照品和夏枯草样品的 HPLC 色谱图（略）2.2 溶液的配制2.2.1 对照品储备液精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品 21.26 mg，齐墩果酸对照品 6.36 mg，置于 10 ml 容量瓶中，加入适量甲醇溶解，定容，摇匀，作为乌索酸和齐墩果酸对照品储备液，备用。2.2.2 夏枯草样品溶液将药材夏枯草在 80 下恒温干燥 12 h，取适量夏枯草于高速万能粉碎机中粉碎，备用。精密称取夏枯草粉末约 2 g，置具塞三角烧瓶中，加入 95 %乙醇溶液 30 ml，超声提取 120 min，放冷，滤过，滤渣再加入少量乙醇，超声洗涤 2 次，合并滤液至 50 ml 容量瓶中，乙醇定容，摇匀，得样品溶液。2.3 标准曲线的绘制精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品储备液 1 ml 至 10 ml 容量瓶中，甲醇定容，摇匀，制成含乌索酸 0.212 6 mg/ml，齐墩果酸 0.063 6 mg/ml 的对照品混合溶液。分别吸取 2 ，6 ，10，14 ，18 l，按 2.1 色谱条件进样测定峰面积，以峰面积（Vs）为纵坐标，进样量（g）为横坐标，进行线性拟合，得乌索酸回归方程为 Y=5.18105X-1.35103，r=0.999 84；齐墩果酸回归方程为 Y = 3.28105 X-1.90103，r=0.999 60，表明当乌索酸进样量在 0.425 23.826 8 g，齐墩果酸进样量在 0.127 21.144 8 g 范围内，线性关系良好。32.4 精密度实验 精密吸取乌索酸和齐墩果酸的对照混合溶液 20 l 进样，乌索酸峰面积相对标准偏差（RSD）为 0.6 %（n=5） ，齐墩果酸的峰面积 RSD 0.9 %（n=5） 。结果表明仪器系统精密度良好。2.5 重现性实验 精密称取同一批夏枯草样品 5 份，每份约 2 g，按样品溶液配制方法制备溶液，精密吸取 20 l 进样分析，乌索酸峰面积 RSD 为 1.1 %（n=5） ，齐墩果酸峰面积 RSD 为1.2%(n=5) 。2.6 加样回收率实验精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量的夏枯草样品 5 份，每份约 1 g，分别加入乌索酸和齐墩果酸对照品储备液 1.0 ml，制备样品溶液。精密吸取 20 l 进样分析，得乌索酸的平均加样回收率为 98.0 %，RSD 为 1.0 %，齐墩果酸的平均加样回收率为 98.7 %，RSD 为 1.4 %。2.7 样品分析结果精密吸取样品溶液 20 l 进样，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定样品中乌索酸和齐墩果酸的峰面积，平行 3 次，计算样品中乌索酸和齐墩果酸的平均含量。结果见表 1。表 1 夏枯草样品中乌索酸和齐墩果酸的测定结果（略）3 讨论3.1 样品提取方法的选择夏枯草中乌索酸和齐墩果酸的提取多采用乙醇回流法11和乙醚索氏提取法，操作时间长，提取工艺复杂，提取率低，而采用超声波提取夏枯草中的两种有效成分，操作简单，提取时间短，提取率高，有利于样品中有效成分的快速富集，具有快速、环保、节省溶剂等优点，提取液中杂质较少，样品经 0.45 m 滤膜过滤后可直接进样，对色谱柱无污染。3.2 样品提取时间的选择考察了不同提取时间对样品中乌索酸提取率的影响。当夏枯草样品超声提取 120 min 后，继续延长提取时间，提取率无明显变化，确定样品的提取时间为 120 min。3.3 检测波长的选择采用光电二极管矩阵检测器，在 190500 nm 波长范围进行光谱扫描，乌索酸和齐墩果酸在流动相中的最大吸收波长均为 202.2 nm（见图 2） ，但短波长处流动相有较强的末端吸收，为避免流动相对检测结果的干扰，提高信噪比，保证系统的灵敏度，选取 210 nm 为检测波长。1.齐墩果酸 2.乌索酸图 2 乌索酸和齐墩果酸对照品的紫外光谱图（略）3.4 流动相和色谱柱的选择乌索酸和齐墩果酸均属三萜类化合物，为同分异构体，两者极性几乎无差别，分离较困难，传统检测方法在测定夏枯草中乌索酸含量时，未能将齐墩果酸和乌索酸分离，测得的乌索酸含量实际为两者的总和。经多次实验，以甲醇-水（8614）体系为流动相，选用 Nucleodur C18 柱实现4了乌索酸和齐墩果酸的良好分离。参考文献：1 郑汉臣,蔡少青. 药用植物学与生药学M.北京: 人民卫生出版社,2004:389. 2 孟正木,何立文. 夏枯草的化学成分研究J.中国药科大学学报,1995,26(6): 329.3 刘悦,宋少江,徐绥绪. 夏枯草的化学成分及生物活性研究进展J.沈阳药科大学学报,2003,20(1): 55.4 刘敬顺. 夏枯草药理作用实验研究简况J. 山西中医,2002,18(2): 52.5 Li J,guo WJ,Yang QY.Effects of ursolic acid and oleanolic acid on human colon carcinoma cell line HCT15J. World J Gadtroenterol,2002,8(3): 493.6 李晓蒙,廖华卫. 夏枯草中熊果酸的含量测定J.广东药学院学报,2003,18(1): 31.7 毛海兴,杨更亮,赵敬相. 毛细管胶束电动色谱法测定夏枯草中两有效成分J.分析化学,2000,28: 1275.8 闫花丽,赵陆华,朱丹妮. 衍生化气相色谱法测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量J.中国中药杂志,1999,24(12): 744.9 王海波,乔智胜,张芝玉,等. 三种夏枯草的薄层层析和紫外光谱研究J.时珍国药研究,1995,7(2): 100.10 刘淑娟,罗明标,林海禄,等. 夏枯草中熊果酸的提取及表征J.化学世界,2005,10: 617.11 吴垠,吴志南. 夏枯草浸膏含量测定方法的研究J. 广东药学,2002,12(2): 27.