细胞生物学实验报告细胞膜渗透性实验 1 山东大学山东大学细胞生物学实验细胞生物学实验报告报告 鸡血红细胞细胞膜的渗透性实验鸡血红细胞细胞膜的渗透性实验 姜政 2012/9/18 实验目的：实验目的： 了解细胞膜的渗透性与不同物质进入细胞的速度，观察鸡血红细胞发生溶血时的细胞形态变化和细胞 悬液通透性变化，理解溶血现象的机制和动态过程。 实验原理：实验原理： 细胞膜是一种选择透过性生物膜，胞外分子可通过自由扩散、协助扩散或主动运输进入细胞。通常， 水分子，气体分子如 C02、O2，脂溶性分子如甘油、维生素，有机小分子如乙醇、尿素等均通过自由扩散以 渗透的方式进入细胞。细胞最主要的单糖营养物质葡萄糖以协助扩散或主动运输进入细胞。 在体外适宜浓度的盐溶液中， 红细胞可保持等渗状态而维持正常形态， 但当体外溶液中盐浓度过低时， 细胞内的渗透压高于细胞外渗透压，水分子将大量渗透进入红细胞， 最终导致红细胞胀破， 血红蛋白泄露， 形成血红蛋白溶液，即发生溶血。在溶血过程中破裂的红细胞并不会完全失去正常红细胞的形态，有研究 表明低渗导致的血红蛋白泄露是由红细胞表面形成的孔道造成的。此外，常造成溶血的因素还有速冻、机 械力、生物或化学毒素等，某些等渗溶液由于细胞膜对不同种溶质通透性不同也可能发生溶血。一般把低 渗溶液中发生溶血后，红细胞破裂留下的细胞结构被称为血影。 图图1. 1. 口形红细胞，盘状红细胞和棘状红细胞之间的平衡口形红细胞，盘状红细胞和棘状红细胞之间的平衡（引自W.H. Reinhart等，1986）。 扫描电镜图从左到右依次为0.002Mm、 0.1mM、 0.5mM氯丙嗪处理的口形红细胞， 正常盘状红细胞， 7.5mM、 30mM和120mM水杨酸钠处理的棘状红细胞。在左数第二幅电镜图中可以看到膨胀红细胞表面的孔洞。 不同分子渗透进入细胞的能力与分子的性质有关，按照相似相容原理，脂溶性分子易于穿过细胞膜， 同时，小分子和非电性分子易于穿膜。因此，不同物质由于分子本身差异，渗透进入红细胞的原理不同， 速度不同，导致溶血的时间也不同，因而可以用溶血时间作为衡量物质进入红细胞速度的一个指标。 本实验以鸡血红细胞为实验材料， 分别以NaCl溶液、 甲醇溶液、丙三醇溶液、葡萄糖溶液和Triton X-100 溶液进行渗透处理。其中等渗和低渗NaCl溶液处理是为了得到正常形态的红细胞和迅速溶血的红细胞（血 影） ，并作为实验的对照。甲醇、丙三醇和葡萄糖三种溶液浓度都高于鸡血红细胞的等渗浓度，三种分子的 分子量依次递增且三种分子都可以通过渗透进入细胞，使细胞胀破，因此通过比较三种溶液溶血的时间可 Stomatocytes Discocyte Echinocytes 细胞生物学实验报告细胞膜渗透性实验 2 以比较不同分子量有机分子进入红细胞的速度。甲醇和丙三醇除了可以渗透进入红细胞，还能直接破坏细 胞膜磷脂双分子层或膜内细胞骨架蛋白的稳定结构，而葡萄糖可能介导红细胞间的粘合。Triton X-100是一 种非离子表面活性剂，可以溶解脂质和部分膜蛋白，一般认为其溶血作用的原理是Triton X-100分子可以插 入细胞膜的磷脂双分子层，导致膜结构的破坏2。有研究表明Triton X-100对细胞磷脂膜具有双重作用，当 浓度很低(0.0001-0.01%, v/v)时，Triton X-100能够抑制溶血，但当其浓度稍高时又将促进溶血3。 图图 2. 2. 三种两性分子结合磷脂双分子层的可能机制三种两性分子结合磷脂双分子层的可能机制（引自 Arnold M. Katz 等，1981） 。 . 膜膨胀；. 钙离子置换；. 环形分裂。 实验材料和试剂：实验材料和试剂： 冷藏鸡血，0.85% NaCl 溶液（鸡血红细胞等渗溶液） ，0.0085% NaCl 溶液，0.8mol/L 甲醇溶液（对鸡血 红细胞的等渗浓度为 0.3mol/L） ，0.8mol/L 丙三醇溶液（对鸡血红细胞的等渗浓度为 0.3mol/L） ，6%葡萄糖 溶液（对鸡血红细胞的等渗浓度为 5%） ，2% Triton X-100 溶液（对鸡血红细胞的等渗浓度为 1.5%） 实验用具：实验用具： 离心机，普通光学显微镜，带有刻度的 10ml 玻璃离心管，胶头滴管，普通玻片 实验步骤：实验步骤： 1. 取冷藏鸡血 7ml 于 10ml 玻璃离心管，向离心管中加入约 3ml 0.85% NaCl 溶液，以 1000r/min 离心 5min。 2. 将离心后的上清液取出，加入与细胞沉淀等体积的 0.85% NaCl 溶液配成 50%（v/v）鸡血红细胞悬液。 3. 取 6 支 10ml 玻璃离心管，分别加入 0.85% NaCl 溶液，0.0085% NaCl 溶液，0.8mol/L 甲醇溶液，0.8mol/L 丙三醇溶液，6%葡萄糖溶液和 2% Triton X-100 溶液各 3ml。 4. 向上述溶液中滴加 1-2 滴 50%鸡血红细胞悬液，轻摇混匀，取悬液进行显微观察，比较不同溶液处理后 红细胞的形态变化，并比较各试管中红细胞悬液的透明度，判断不同溶液中的溶血状态和速度。 细胞生物学实验报告细胞膜渗透性实验 3 实验结果：实验结果： 图图 3 3. . 不同溶液处理后鸡血红细胞的形态变化。不同溶液处理后鸡血红细胞的形态变化。 a. a. 0.85% NaCl 溶液中的红细胞，细胞保持较正常形态，可见细胞核；b b、c. c. 0.0085% NaCl 溶液处理约 1min 后 的红细胞，大部分细胞吸水胀破，小部分细胞胀大呈扁平球形（图中箭头所示） ；d. d. 0.0085% NaCl 溶液处理 约 30min 后的红细胞，此时几乎所有细胞已完全胀破；e e、f f、g. g. 0.8mol/L 甲醇溶液处理约 2min 后的红细胞， 部分细胞破裂，部分细胞仍保持完整形态（图中箭头所示） ；h. h. 0.8mol/L 甲醇溶液处理约 5min 后的红细胞， 多数细胞破损；i i、j. j. 0.8mol/L 丙三醇处理约 20min 后的红细胞，多数细胞未发生破裂，部分细胞边缘处产生 液滴状 “缺口”（图中箭头所示） ， 系丙三醇进入细胞后未完全溶解导致； k. k. 0.8mol/L 丙三醇溶液处理约 40min 后的红细胞， 多数细胞形状怪异， 或已破裂； l l、 m.m. 6%葡萄糖处理约 15min 后的红细胞， 细胞形态比较正常， 细胞生物学实验报告细胞膜渗透性实验 4 无破裂细胞， 但细胞核突出 （图中箭头所示） ， 说明细胞正经历失水； n. n. 6%葡萄糖处理约 60min 后的红细胞， 细胞形态比较正常，仍无破损细胞；o. o. 2% Triton 溶液处理约 2min 后的红细胞，几乎所有细胞破裂，且溶液 浑浊度较高，以致显微镜视野模糊，无法看清细胞轮廓。 图图 4 4. . 不同溶液处理后离心管中鸡血红细胞悬液的透明情况比较。不同溶液处理后离心管中鸡血红细胞悬液的透明情况比较。 0.85% NaCl 溶液中细胞悬液的透明度在 90min 内无明显变化， 长时间静置后离心管底部有细胞沉淀； 0.0085% NaCl 溶液处理后细胞悬液立即变澄清（小于 30S） ，在所有悬浮液中透明度最高，说明发生了明显的溶血现 象；0.8mol/L 甲醇溶液处理的血红细胞悬液在约 1min 后即变得均一（无悬浮状细胞团） ，呈半透明状，其 透明度高于等渗悬液（上图左数第一支离心管）但低于完全破碎液（上图左数第二支离心管） ，说明仍有部 分细胞未发生破裂，这与显微观察结果相符；0.8mol/L 丙三醇溶液处理 60min 后的红细胞悬液透明度介于 等渗溶液与完全破碎液之间，说明细胞膜对丙三醇的通透速率比较慢，仍有部分部分血细胞未破裂；6%葡 萄糖溶液中滴加 50%红细胞悬液后发生凝血现象，悬液中有大量细胞凝集团，可能与葡萄糖介导的细胞凝 集有关；2% Triton 溶液中滴加红细胞悬液后无絮状细胞团悬浮物，但悬液透明度不高，介于等渗悬液和完 全破碎液之间，其胶体状浑浊主要是由 Triton 溶解细胞膜后游离出的蛋白质大分子造成的。 表表 1 1. . 不同溶液处理导致红细胞不同溶液处理导致红细胞溶血的大致溶血的大致时间时间(以多于 90%红细胞破裂为准)。 溶液 0.85% NaCl 0.0085% NaCl 0.8mol/L 甲醇 0.8mol/L 丙三醇 6%葡萄糖 2% Triton 时间 90min 60min 90min 60s 讨论：讨论： 本实验只着重考虑了不同溶液溶质分子跨膜的性质， 事实上， 溶液离子强度也是影响溶血的重点因素， 因为离子强度的变化可能导致细胞膜对离子型表面活性剂的吸附发生变化，进而改变细胞膜的渗透性或导 致细胞膜被表面活性剂溶解4。 甲醇除了可以迅速渗透进入红细胞导致红细胞胀破，还可能直接参与破坏了细胞膜的结构。有研究表 明甲醇的同系物乙醇能导致破坏细胞骨架蛋白， 使细胞膜表面产生直径约十几埃的小孔并伴有 K+外流7, 8。 丙三醇渗透进入红细胞的速度比甲醇小很多，而且有研究证明丙三醇渗透进入细胞的过程依赖细胞膜 上的水通道蛋白6, 9。在实验显微观察中，丙三醇处理过的红细胞在 30min 内出现了贴近内膜的小液滴， 30min 后又几乎看不到小液滴存在，这可能与丙三醇较大的密度有关。 实验中有的小组在用 6%葡萄糖溶液处理红细胞时发现红细胞会很快凝集，情况类似凝集素导致的红细 胞凝集。在临床血液的保存中，葡萄糖可被用于红细胞的保存，虽然会对膜功能造成损害，但高浓度的葡 萄糖（4g/dl）确能增强细胞膜的稳定性，这与葡萄糖增加了溶液的同渗重摩有关10。所以，根据实验现 细胞生物学实验报告细胞膜渗透性实验 5 象推测，造成红细胞凝集的可能原因是葡萄糖造成了细胞膜表面某些组分的糖化，进而诱导了某种凝集素 介导的细胞膜粘连，也可能是高渗的葡萄糖溶液在不能很快破裂红细胞的情况下打破了红细胞内的离子平 衡，渗出的阳离子介导了细胞之间的粘连。 非离子去污剂（Triton X-100 等）常被用于膜蛋白的提取3，这与其作用细胞膜的原理直接相关。有较 早的研究发现 Triton X-100 处理后的血影细胞膜结构将发生显著变化， 正常血影膜的光滑表面和尖锐边缘会 变成由浓密的网状结构5。由于破坏了磷脂双分子层的结构，原先结合在细胞膜上的膜蛋白将失去有效支 持物而脱离细胞膜，这是实验中 Triton X-100 作用后红细胞悬液变成胶体状浑浊的主要原因。 图图 5. 5. 正常血影与正常血影与 Triton XTriton X- -100100 处理后血影的电镜处理后血影的电镜负染负染照片。照片。（引自 John Yu 等，1973）。 、为正常血影电镜照片，血影膜具有光滑的表面和尖锐的边缘；、为 Triton X-100 处理后血影 的电镜照片，显示血影膜磷脂分子层结构发生显著改变。照片比例尺为 1m。 参考文献：参考文献： 1. W.H. Reinhart and S. Chien. Red cell rheology in stomatocyte echinocyte transformation: Roles of cell geometry and cell shape. Blood 67, 11101117, 1986. 2. Arnold M. Katz and Frank C. Messineo. Lipid-membrane interactions and the pathogenesis of ischemic damage in the myocardium. Ciculation Reaserch, vol.48, No.1:1-16, Jan