4 无菌操作技术,一、外植体的选择与处理 二、外植体的接种和培养 三、试管苗的驯化与移栽 四、常见问题与解决措施,一、外植体的选择与处理 （一） 外植体的选择 （二） 外植体的处理 （三）污染问题及解决措施,（一）外植体的选择 植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。,1. 选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。,2. 选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。,3.选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高；花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。,4.选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。,(二)外植体的处理 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。,常规的表面灭菌处理方法 把材料放进75%的酒精中约30 60s。 用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡1520min。 无菌蒸馏水冲洗35次。 灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润剂，能增强灭菌效果。,常用灭菌药剂的使用和效果,（三）污染问题及解决措施 1. 污染的原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 污染的原因：从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。,细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后12天即可发现。 原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。,真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后310天才能发现。 原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。,2.污染的预防措施 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几种预防措施。,（1）防止材料带菌 用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水促使抽枝，以这种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污染。 或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。,选择合适的时间去田间采取外植体 避免阴雨天去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。,目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，要剥去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。,（2）外植体的灭菌 多次灭菌法：一是将切好的外植体放入2.5%的次氯酸盐溶液中消毒20-30min；二是在无菌蒸馏水中冲洗3次；三是将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；四是第二天再将外植体用2.5%次氯酸钠灭菌20-30min，然后用蒸馏水洗3次。对层积过的种子可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌。,对易污染而难灭菌的材料用多种药液交替浸泡消毒： 一是将外植体用洗涤液充分洗净并修整干净； 二是将材料放入75%洒精中灭菌30-60s； 三是在1：500的Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min； 四是在2.5%次氯酸钠溶液中灭菌2030min； 五是用无菌水冲洗5次，或放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）中浸15-20s，再用无菌水冲洗数次。,（3）玻璃器皿的灭菌 湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min30min。 干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。,（4）金属器械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒 精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进 行。 干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用 纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。,（5）布质制品的灭菌 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/厘米2 （即15磅/英寸2），121C的温度，灭菌20 min30min。,（6）无菌操作室的灭菌 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔敏或75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 （7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行,二、外植体的接种和培养 （一）外植体的接种 （二）外植体的培养,外植体的接种是把经过表面消毒后的植物材料切碎 或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养 基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操 作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员 本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防 止工作人员本身引起的污染。,（一）外植体的接种,1操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。进入接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果, 进行操作前再用75%的酒精擦洗双手。,无菌操作室的灭菌 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期1-2次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。,2操作期间经常用75%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如：器械被手污染后又污染培养基。,3在打开培养瓶时，最大的污染危险是管口边沿沾染 的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火 焰烧瓶口。 如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热 度，以杀死存在的细菌。 为避免灰尘污染瓶口，可用纸或者保鲜膜包扎瓶 口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污 染机会。,4工具用后及时消毒，避免交叉污染。 5工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。,6由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。 刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中或插在器械灭菌器中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。,（二）外植体的培养 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。 培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。,1光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重 要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下 有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也 有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长 需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮， 促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。,普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx- 5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。,2温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所用的温度是25C2C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。,3湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。,4氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。,