Western Blot 个人个人总结详细版总结详细版 单层贴壁细胞蛋白提取及半干转法为例 中山大学临床检验诊断学硕士刘记 2016/11/14 1蛋白蛋白制样制样 A贴壁单层细胞贴壁单层细胞的处理：的处理： 1）60mm 细胞培养皿按 200ul/皿，准备 RIPA 裂解液【6 孔板 100ul/孔，按底面积换算，用 量不能过多，不然后续蛋白浓度过稀，无法保证 15ul 有足够的蛋白上样量】 2）使用前将 CockTail 按 1:100 加入 RIPA，混匀，冰上备用 3）收取培养上清后，预冷 PBS 洗涤两遍【洗涤干净培养基，防止 BCA 培养基颜色干扰】 4）200ul/皿，加入 RIPA 裂解液，冰上放置 5 分钟，轻晃使裂解液铺匀整个底面细胞 5）冰上操作，细胞刮刷将细胞刮向一侧，加样枪收样到标记好的 EP 管，冰上放置 6）离心，4，14000Xg，15min 7）冰上操作，收上清至新标记好的 EP 管，冰上放置 BBCA 测定测定蛋白浓度：蛋白浓度： 按照碧云天 BCA 试剂盒说明书操作即可 1）收取蛋白样品稀释 10-20 倍测浓度 2）蛋白标准品在公用-20冰箱 2 层 C C蛋白蛋白浓度调整：浓度调整： 1） 根据 BCA 蛋白浓度测定结果， 按 15ul 上样体积 【15-20ul】 ， 40ug 总上样量 【30-100ug】 ， 等体积，等蛋白量上样调整浓度至一致 2）加入 5XSDS 蛋白上样缓冲液 3ul，剩余 12ul 由上样蛋白和 PBS 补足 3）按照计算好的每个 15ul 总体积需要加入的蛋白体积，PBS 体积，5XSDS 蛋白上样缓冲液 体积，按 6 个 15ul 即 90ul 总体积，用量各 X6 配总体系【0.5mlEP 管】 ，煮沸 5min 后再分 装到每个小的 EP 管 4）用 0.5mlEP 管配总体系，煮沸 5min【使用 0.5mlEP 管，煮沸时不易进水】 5）分装至 0.2mlEP 管【不要用 0.2ml 的 EP 管煮沸，易进水，改变总体积】 ，-80保存备用 2 2SDSSDS- -PAGEPAGE A A配胶配胶【以【以 1.01.0mmmm 厚度厚度 minimini 胶为例】胶为例】 1）按照目的蛋白分子量大小选择适合浓度的分离胶 2）选用新配置 AP，4保存 3） 将玻璃板洗洁精洗涤干净， 自来水冲洗干净， 烘箱烘干备用； 固定架上的软垫洗涤干净； 梳子洗涤干净，烘干备用 4）配胶用小烧杯洗净，倒扣纸巾吸干水滴，严格按照相应浓度分离胶的配方加入各种组分 5）按照每块 mini 胶 5ml 用量配置分离胶，3ml 用量配置浓缩胶 6）加入 TEMED 后，迅速将分离胶倒入 15ml 离心管，迅速倾倒入玻璃板之间至绿色内边接 近上缘， 最后用 1ml 加样枪补加少量分离胶至绿色内边上缘 【此步骤速度要快， 防止凝固， 2 0 16 . 11. 14 刘记 导致分离胶上缘不平】 7）尽快用 1ml 加样枪加无水乙醇进行液封，将分离胶上缘压平 8）可观察配分离胶小烧杯剩余分离胶是否凝固，判断配胶是否出现问题，不凝固最常见问 题是 AP 失效 9）待分离胶与无水乙醇间出现明显分界线，5min 左右，快速倒去无水乙醇，滤纸沿边缘吸 干 10）按照配方配置浓缩胶，加入 TEMED 后，用 1ml 加样枪迅速加满玻璃板，除去任何气泡 11）将洗净的梳子迅速斜行划入，垂直压下，观察严禁梳子下方出现气泡，静置 30min【跟 室温和 AP 活性有关，可放入湿度温箱加速凝固】 12）通过观察配浓缩胶小烧杯剩余浓缩胶的凝固情况判断配胶是否出现问题 13）蛋白胶的保存，放入小袋，加少量单蒸水，保证胶润湿，常温保存可一周【4保存过 久易出现裂胶】 B B蛋白上样蛋白上样 1）将配好的两块蛋白胶玻璃板用夹子夹在一起，小玻璃板向内，带字玻璃板向外，组成内 电泳槽，放入大电泳槽，内外槽均加满 1X 的 SDS 电泳缓冲液 2）在电泳缓冲液浸没的情况下，垂直向上轻轻拔出梳子【禁止干拔梳子，易致泳道破裂或 粘合】 3）蛋白上样，mini 胶每孔上样蛋白体积最好 15ul，最多不超过 20ul，否则容易出现蛋白样 品外溢，进入其它泳道或者曝光易出现-actin 的相连成线，上样预染蛋白 marker，并记录 蛋白样本次序，记住靠近 marker 的样本【若为了保证蛋白样本跑胶整齐不偏斜，可以在蛋 白样本两侧各加一个泳道的蛋白 marker，向内压】 C C电泳电泳 1）按照对应红色黑色电极盖上电泳槽盖子，插上电极 2）打开电源开关，调整电压 80V，观察电泳槽出现小气泡上浮，证明正在电泳 3） 2h 左右， 观察溴酚蓝位置， 待溴酚蓝刚跑出内电泳槽绿色底边时， 终止电泳， 关掉电源， 拔下电极，盖子 3 3转膜转膜- -半干转法半干转法 1）预先配好 1L 干转专用转膜缓冲液，向小瓷盘倒入一定量转膜液 2）将干转专用滤纸两厚张浸入转膜缓冲液，准备干净的玻璃棒，镊子放入转膜液 3）用绿色塑料小撬板将小玻璃板撬开，切除浓缩胶，立刻在分离胶一侧切除部分分离胶做 标记，标注正面，如果分离胶底部出现一定量的溴酚蓝弥散，可以在玻璃分离胶之前，用手 术刀片直接切除底部弥散溴酚蓝的分离胶； 在电泳缓冲液里小心撬开分离胶， 用撬板拖入转 膜液内 4）干转仪地面加少量转膜液润湿，从下向上一次放置滤纸滤纸，NC 膜膜，分离胶分离胶，滤纸滤纸，每放入 一层，立即用玻璃棒排出气泡，再加一定量转膜液；放下 NC 膜后即可用刀片在一角切除标 记正面；放下分离胶之后，玻璃棒赶气泡时玻璃棒赶动方向应与蛋白泳道连线平行，轻轻赶 动 5）盖好转膜仪盖子，插上电极，打开开关，调整电压 15V，40min，转膜 4 4封闭封闭 1）转模后，用镊子小心将 NC 膜取出 2）在桌面保鲜膜上加少量 TBST，按照预知的目的蛋白分子量 KD 大小，参照预染 marker 位 置，用刀片切下 NC 膜，至少多切上下各 1 个 marker 位点 3）摇床中等转速，TBST 洗涤 2 次，10min/次 4）用 5%脱脂奶粉（TBST 配置） ，在抗体孵育盒内，每个格子加入 5ml，放入剪切好的 NC 膜 5）摇床，最小转速，室温孵育 2-3 小时 5 5孵孵一抗一抗 1）回收封闭液，4保存，一周可反复用三次 2）摇床中等转速，TBST 洗涤 2 次，10min/次 3）用一抗专用稀释液稀释一抗【一抗稀释液碧云天购买或者用 TBST 配置 5%BSA 作为一抗 稀释液】 4）每格加入 5ml 一抗稀释液 5）摇床，最小转速，4孵育过夜 6 6孵孵二抗二抗 1）回收一抗稀释液，4保存，可反复使用多次，不少于 6 个月 2）摇床中等转速，TBST 洗涤 2 次，10min/次 3）用封闭液 5%脱脂奶粉（TBST 配置）稀释二抗 4）每格加入 5ml 二抗稀释液 5）摇床，最小转速，室温孵育 2-3 小时 7 7化学发光化学发光 1）回收二抗稀释液，4保存，可反复使用多次 2）摇床中等转速，TBST 洗涤 2 次，10min/次 3）1:1 配置好化学发光工作液【碧云天】避光操作，避光保存；按每张膜 1ml 量配置 4）带上镊子，干净玻璃平皿，1ml 加样枪，枪头，发光工作液 5）在化学发光仪上曝光拍照 8 8配置溶液配置溶液 1）10%SDS用于配胶，常温保存 2）AP新鲜配置，4保存 3）20%TWEEN配置 TBST 需要使用 4）转膜缓冲液按照配方配置 2X 储存液，用前单蒸水稀释至 1X 5）电泳缓冲液公用 5X 储存液，用前单蒸水稀释至 1X，或者按配方自己配置 6）TBS商品化粉末溶解即可 7）TBSTTBS 和 20%TWEEN 配置 8） 配胶所需其他几种成分 （30%丙烯酰胺， 0.5M Tris6.8, 1.5M Tris8.8， TEMED） ， 5XSDS loading buffer，TBS 粉末，可以购买商品化产品 9 9注意事项注意事项小结小结 1）电泳缓冲液可配置 2X 或 5X，使用之前用单蒸水稀释至 1X，最好不要用 PBS 稀释，影响 组分及导电性 2）转膜缓冲液最好自己配置，可配置 2X，用前单蒸水稀释至 1X，干转 15V 恒压时初始电流 应在 800-900mA 才正常； 若购买转膜液粉末需问清楚是湿转还是干转用途， 湿转用转膜液， 15V 恒压转膜，初始电流 300mA 左右，不适合干转 3）拔梳子禁止干拔，应夹好夹子完全浸没在电泳缓冲液中湿拔 4） 资料： 转膜用 NC 膜不分正反面， 注意孔径选择： 0.45m-大于 20KD， 0.22m-小于 20KD； 自己自己实验证明实验证明统一统一选用选用 0.45m 可以做出结果可以做出结果 5）丽春红染色主要目的是 NC 膜上蛋白，判定是否成功转膜，并可助于染色条带剪切出目 的蛋白位点的 NC 膜条带，剪下的 NC 膜用 TBST 洗涤去除丽春红染色，放入孵育盒开始封 闭；丽春红染色步骤可以省略丽春红染色步骤可以省略，前提是清楚确定目的蛋白所在位置 6）封闭选用进口脱脂牛奶溶于 TBST 中配置 5%脱脂牛奶，室温慢摇不少于 2h 7）一抗用一抗专用稀释液或者 TBST 配置 5%BSA（不能用脱脂牛奶，易变质） ，4慢摇至少 孵育过夜一抗专用稀释液稀释的一抗可半年内多次反复使用；一抗可 4孵育过夜或两天， 不影响效果 8）二抗用封闭液稀释，室温慢摇不少于 2 小时 9）每次更换孵育液前用 TBST 进行洗膜，10min/次，洗涤 2 次，快摇 10） 剪切好的膜放在抗体孵育盒内， 进行封闭， 孵一抗， 孵二抗及洗膜过程中， 不用拿出膜， 可直接倾倒液体 11）加发光液前，将 NC 膜从 TBST 洗涤液夹出，反面放在纸巾吸干液滴，不要正面摩擦纸 巾，防止蛋白脱落