1耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药特征及耐消毒剂基因的检测分析作者：颜英俊 糜祖煌 刘华 杨洋 张凯 杨明清 黄文方 【摘要】 目的 分析和调查我院 2005 年 1 月12 月临床分离 34 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药特点以及耐消毒剂相关基因携带状况。方法 应用 BD Phoenix100 全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和 17 种药物敏感试验，头孢哌酮/舒巴坦采用 KB 法。用 PCR 方法检测季胺类(如苯扎溴铵)、双胍类(如氯己定)耐药相关基因 qacE1sul1 。结果 亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星 100%敏感外，对哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦敏感率为 48%54%，对第三代及第四代头孢菌素、氨曲南和喹诺酮类等抗菌活性差，敏感率为 3%29%，对美罗培南敏感率为 29%，对氨苄西林/舒巴坦、氯霉素、四环素、复方磺胺甲口恶唑全部耐药。34 株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌有 14 株 qacE1sul1 基因阳性，携带率为 41.2%。结论 本组亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星敏感外，对其它常用抗生素耐药严重，且耐消毒剂相关基因阳性携带率较高，应引起临床微生物和消毒界的重视。 【关键词】 铜绿假单胞菌 亚胺培南 消毒剂 耐药基因Investigation on the antimicrobial resistance characteristicsABSTRACT Objective To investigate the antimicrobial resistance characteristics and the condition of disinfectantresistant gene (qacE1sul1) in 34 imipenemresistant Pseudomonas aeruginosa. Method Thirtyfour strains from patients from Jan to Dec 2005 were identified and drug susceptibility test were performed by BD Phoenix100 automatic microbial analysis system, cefoperazone/sulbactam susceptibility test was performed by KirbyBauer method. The qacE1sul1 gene was detected by PCR method. Results Imipenemresistant Pseudomonas aeruginosa were all susceptible to amikacin, 48%54% were susceptible to piperacillin and pipercillin/tazobactam,respectively. Only 329% were susceptible to the other cephlosporins, aztreonam and quinolones. There were 29% of Pseudomonas aeruginosa susceptible to meropenem and all resistance to amoxicillin/clavulanate, chloramphenicol, tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole. Fourteen of 34 strains were qacE1sul1gene positive, and the carrying rate was 41.2%. Conclusion The resistance status of Pseudomonas aeruginosa to imipenem is serious. There is high positive percentage of qacE1sul1 gene in imipenemresistant Pseudomonas aeruginosa.2KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa; Imipenem; Disinfectants; Resistance gene铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上常见的、重要的条件致病菌，同时也是医院感染常见的和主要致病菌。铜绿假单胞菌可引起多种感染，对多种常用抗生素耐药，给临床治疗带来很大的困难。碳青霉烯类抗生素(如亚胺培南)以其广谱的抗菌活性，被临床广泛用于治疗重症感染。但近年来，由于外膜蛋白 D2 缺失、产酶、外排泵、生物膜等耐药机制1，2 ，铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性逐年下降。2005 年黄支密等3从多重耐药 MRSA 中发现耐消毒剂基因 qacA。细菌耐消毒剂为获得性的 qac 基因所致，其中 qacEsul1 基因由整合子介导，可被革兰阳性和革兰阴性菌广泛获取4，5 。为了解我院耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa)的耐药特点及消毒剂 磺胺耐药相关基因(qacE1sul1) 存在状况，我们进行了相关分析和研究，现总结报告如下。1 材料和方法1.1 菌株来源34 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于 2005 年 1 月12 月我院住院患者的临床分离标本(包括痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等)。1.2 质控菌株铜绿假单胞菌 ATCC27853 和大肠埃希菌 ATCC25922 购自卫生部菌种保藏中心。1.3 菌株鉴定及药敏试验方法所有菌株均以 BD Phoenix100 全自动微生物分析仪鉴定到种，必要时采用ATB 或传统生化方法补充鉴定。采用 BD Phoenix100 配套药敏试验复合板，包括阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟、四环素和复方磺胺甲口恶唑共 16 种抗生素，头孢哌酮/舒巴坦采用 KB 法，药敏标准按 2005 年版 CLSI/NCCLS M100S15 规定执行。1.4 主要仪器设备与试剂Eppendorf centrifuge 5417R 低温离心机，恒温金属浴(杭州大和公司)，MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)，BioRAD 电泳仪，BioRAD 凝胶成像系统，琼脂糖(Oxoid 公司)，100bp DNA Ladder Marker(大连宝生物工程公司)，6上样缓冲液(北京天为时代公司)，头孢哌酮/舒巴坦药敏纸片(Oxoid 公司)。31.5 模板 DNA 提取采用蛋白酶 K 消化法。1.6 基因扩增按美国国立生物技术信息中心(NCBI)已登陆的 qacE1 基因序列(登陆号U12338)自行设计引物，P1：5TAGCGAGGGCTTTACTAAGC3 ，P2：5ATTCAGAATGCCGAACACCG3，扩增产物为 300bp。优化后的 PCR 反应体系为：P1、P2 引物各0.5mol/L，dNTPs 各 200mol/L，KCl 10mmol/L(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl(pH9.0)10mmol/L ，NP40 0.5%，Taq DNA 聚合酶 1U。全部反应体积 20l，其中模板液 5l。热循环参数为：93预变性 3min93 30s55 30s72 60s，最后一个 72延伸 5min，共循环 35 周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。1.7 结果判断取 10l 扩增产物与 2l 6上样缓冲液混匀，点样于 1.5%琼脂糖凝胶，在 100V 电压电泳 30min，出现 300bp 的条带即为 qacE1sul1 基因阳性。用凝胶成像系统观察并照相。 2 结果2.1 耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药耐药特征见 Tab.1。2.2 耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐消毒剂34 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐消毒剂基因阳性株 14 株，占 41.2%，琼脂糖凝胶电泳结果见 Fig.1。3 讨论亚胺培南是第一个应用于临床的碳青霉烯类抗生素，除了有些种属细菌(如嗜麦芽寡养单胞菌、黄杆菌属等)对亚胺培南天然耐药外，目前仍是治疗革兰阴性杆菌感染最有效的抗生素。但近年来铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性有逐年增加趋势6，7 。铜绿假单胞菌是医院感染常见病原菌，由于耐药和多重耐药，对临床感染控制构成严重威胁，而对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌具有更大的危险，因此铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性和耐药机制研究引起国内外学者的广泛关注。我院 34 株 IMPRPa 全部对阿米卡星敏感(敏感率 100%)，但对庆大霉素只有 29%敏感，可能是阿米卡星对铜绿假单胞菌产生的氨基糖苷类钝化酶较稳定。哌拉西林和哌拉西林/三唑巴坦对铜绿假单胞菌有较强的抗菌活性，敏感率48%54%，第三代及第四代头孢菌素、氨曲南、喹诺酮类等抗菌活性差，敏感率为 3%29%。有 29%的 IMPRPa 对美罗培南敏感，提示铜绿假单胞菌对亚胺培南和4美罗培南的耐药机制不尽相同。34 株菌对氯霉素、复方磺胺甲口恶唑、四环素全部耐药，因此应加强细菌耐药监测和合理使用抗生素，避免 IMPRPa 引起医院感染流行。消毒剂通常分为高效、中效和低效三类，中效消毒剂因有较高的腐蚀性、刺激性，只用于医疗器具的消毒；低效消毒剂因无刺激性、无腐蚀性可用于人体皮肤、黏膜的消毒，这类消毒剂主要有季胺类消毒剂(如苯扎溴铵、度米芬)和双胍类消毒剂(氯己定等)。在我国这些消毒剂仍广泛用于伤口消毒，如眼部、膀胱、阴道冲洗消毒及外科前皮肤、黏膜准备和外科医生手消毒。qac 基因家族表达多种化合物外排泵，细菌获得 qac 基因并表达，可将季胺类、双胍类和碱性染料排出菌体。目前发现的 qac 基因家族有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacEsul1 、qacF13 等。其中耐消毒剂基因 qacE1sul1 是 I 类整合子的一部分，由整合子介导，可被革兰阳性和革兰阴性细菌广泛获取3，4 。研究结果显示，34 株 IMPRPa 菌 qacE1 基因携带率较高，为 41.2%。sul1 为二氢蝶酸合成酶的编码基因，基因检测阳性提示细菌对磺胺类药物耐药。本组 34 株试验菌对磺胺类全部耐药，但只有 41.2% sul1 基因阳性，提示可能存在其它耐磺胺类的机制。综上所述，铜绿假单胞菌为医院感染常见菌，IMPRPa 对常用抗生素耐药不容乐观以及较高的 qacE1sul1 基因携带率值得我国临床微生物和消毒界的广泛重视。【参考文献】1 刘永芳，吕晓菊. 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性J. 中国抗生素杂志，2005，30(11)：6992 谢轶，杨维清，贾文祥，等. 铜绿假单胞菌耐药性在生物被膜形成过程中的变化J. 中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(4)：3143 黄支密，陈亚华，诸葛青云，等. 多重耐药 MRSA 耐消毒剂基因及抗生素耐药相关基因检测J. 中国抗生素杂志，2005，30(5)：2704 Kazama H, Hamashima H, Sasatsu M, et al. Distribution of the antisepticresistance gene qacE delta 1 in grampositive bacteria J. FEMS Microbiol Lett,1998,165(2):2965 Ka