,细胞凋亡与疾病,第一节 概 述 概念 apoptosis 由体内外因素触发的、基因调控的、主动而有序的细胞自我消亡过程 同义词 程序性细胞死亡 (Programed cell death，PCD),生理意义,确保正常发育、生长 维持内环境稳定 发挥积极的防御功能 病理意义 该“死”的细胞未死-肿瘤、自身免疫性疾病 不该“死”的细胞死了-早老性痴呆、IRI,细胞凋亡与细胞坏死的区别,细胞凋亡 细胞坏死 性质 生理性或病理性 病理性 特异性 非特异性 诱导因素 较弱刺激 强烈刺激 非随机发生 随机发生 形态变化 细胞皱缩 细胞肿胀 核固缩 无核固缩 胞膜及细胞器相对完整 细胞结构全面破坏 细胞内容物无释出 细胞内容物释出,细胞凋亡 细胞坏死,生化特点 主动过程，耗能 被动过程，不耗能 有新蛋白合成 无新蛋白合成 DNA电泳 DNA片段化降解 DNA弥散性降解 180-200bp或整数倍 大小不一 “梯”形条带状 “涂片”样 炎症反应 无 有 凋亡小体 有 无 基因调控 有 无,细胞凋亡与坏死的比较,第二节 细胞凋亡的过程与调控,细胞凋亡的过程 凋亡信号转导 凋亡基因激活 细胞凋亡执行 凋亡执行器：DNase、Caspases 凋亡细胞清除 巨噬细胞或其他细胞,细胞凋亡时的主要变化,形态学改变 （1）微绒毛消失 （2）空泡化 （3）固缩 （4）出芽 （5）染色质边集 （6）凋亡小体,生化改变,细胞凋亡过程中可出现各种生化改变，其中DNA的片段化 断裂及蛋白质的降解尤为重要。 内源性核酸内切酶激活 endogenous nuclease, DNase,概念,是一类以无活性的形式存在于细胞核内的双链DNA内切酶 同义词 凋亡性核酸内切酶（apoptosis endonuclease） 机制 1、 DNase的活性可能与拓扑异构酶有关 TopoI TopoII（解旋作用） 2、Ca2+、Mg2+激活而Zn2+抑制DNase的活性,作用,切割DNA双链 部位：核小体连接部 大小：180-200bp或其整数倍 结果： DNA片段化断裂 凋亡蛋白酶激活 cysteine-containing aspartate-specific proteinase, caspases,概念,是一组对底物天门冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶 同义词 含半胱氨酸的天门冬氨酸特异水解酶 半胱天冬蛋白酶 组成 caspase-1-caspase-13,分类,1、启动子caspases：1、2、4、5、8、10、11 2、效应子caspases：3、6、7、9、12 机制 1、受体激活途径 2、线粒体激活途径 作用 1、蛋白水解酶作用 2、灭活细胞凋亡的抑制物（Bcl-2等） 3、参加凋亡级联反应，最后形成caspase-3,特征性蛋白质出现,硫酸糖蛋白-2 （又称簇素 clusterin） Sulfated glycoprotein-2, SGP-2 Fas蛋白（抗原）,细胞凋亡的调控,细胞凋亡相关因素 诱导性因素 (1)激素和生长因子失衡 (2)理化因素 (3)免疫性因素 (4)微生物学因素,抑制性因素,(1)部分细胞因子 (IL-2,4,6、NGF、CSFs等) (2)部分激素 ACTH、睾九酮、雌激素等 (3)其他 二价金属阳离子 ：Zn2+ 药物 ：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂 病毒 ：EB病毒，牛痘病毒 中性氨基酸,细胞凋亡信号的转导,途径 (1)cAMP/PKA信号转导系统 (2)胞内Ca2+信号转导系统 (3)神经酰胺信号转导系统 (4)Fas蛋白Fas配体信号系统 (5)NF-B和AP-1信号转导系统,(6)TPK信号转导系统* (7)DG/PKC信号转导系统* 特点 (1)多样性 (2)耦联性 (3)同一性 (4)多途性,细胞凋亡相关基因,抑制凋亡基因 Bcl-2、EIB、P53（突变型）等 促进凋亡基因 Bax、Fas、P53（野生型）等 双向调控基因 c-myc、Bcl-X(L,S)等,Bcl-2 B细胞淋巴瘤白血病-2 （B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2） 是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因 主要机制： 直接的抗氧化； 抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质，如：Cyt.C，AIF； 抑制促凋亡性调节蛋白Bax、Bak的细胞毒作用； 抑制凋亡蛋白酶的激活； 维持细胞钙稳态。,第三节 细胞凋亡的发生机制,氧化损伤 氧化应激的概念 oxidative stress 氧自由基化学性质活泼，破坏机体正常的氧化还原的动态平衡，造成生物大分子(核酸、蛋白质、脂质)的氧化损伤，干扰正常的生命活动而形成的危急状态,氧化应激引起细胞凋亡的可能机制,1OFRDNA损伤野生型P53基因apoptosis 2OFRDNA损伤聚ADP核糖转移酶NAD快速耗竭，ATP大量消耗apoptosis 3OFR膜脂质过氧化反应细胞膜损伤apo Ca2+内流 诱发 过氧羟基24碳四烯酸, 4OFRCa2+Mg2+依赖的DNase apoptosis 5OFR线粒体损伤凋亡启动因子apo 6OFRNF-B、AP-l apoptosis 钙稳态失衡 钙稳态失衡的概念 calcium dyshomeostasis 指细胞内钙超载,钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制,1 Ca2+Ca2+Mg2+依赖的DNase apo 2 Ca2+谷氨酰胺转移酶催化细胞内肽链间的酰基转移肽链间形成共价键细胞骨架蛋白交联apoptosis 3 Ca2+NF-B、AP-l apoptosis 4 Ca2+ DNA链在ATP的配合下舒展暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点利于DNase切割DNA apoptosis,线粒体损伤,线粒体损伤的概念 线粒体膜功能的改变和膜结构上完整性被的破坏，表现为线粒体跨膜电位(m)下降，线粒体膜通透性增大 证据显示：线粒体功能失调在细胞凋亡的发生发展中起关键性作用 线粒体损伤引起细胞凋亡的可能机制,恶性网络假说,Deleterious network hypothesis 氧化损伤、钙稳态失衡、线粒体损伤三者在细胞凋亡的发生上既可单独启动，又可联合作用，是许多凋亡诱导因素的共同通路，事实上这三种机制常常是互相联系，互为因果。,第四节 细胞凋亡的常用研究方法,形态学观察 DNA降解分析 流式细胞仪检测 3-OH原位末端标记（TUNEL法） Caspases酶学检查 凋亡基因检测,第五节 细胞凋亡与疾病,细胞凋亡不足 (一)肿瘤 特点：细胞增殖过度 细胞凋亡不足 机制：Bcl-2基因的过度表达 野生型P53基因突变或缺失 肿瘤C获得了对Fas诱导凋亡的抵抗性,（二）自身免疫性疾病 特点：1、自身抗原受到自身抗体攻击 2、自身抗原受到致敏T淋巴细胞的攻击 机制：自身免疫性T细胞凋亡不足 细胞凋亡过度 （一）MIRI 特点：1、缺血早期以凋亡为主，晚期以坏死为主 2、梗死灶中央以坏死为主，周边以凋亡为主 3、轻度缺血以凋亡为主，重度缺血以坏死为主,4、在一定时间范围内，IRI时发生的细胞凋亡比同时间的单纯缺血更严重 5、急性、严重的心肌缺血以心肌坏死为主 慢性、轻度的心肌缺血则发生细胞凋亡 机制：1、氧化应激 2、钙稳态失衡 3、Fas基因表达，Bax基因表达 4、Bcl-2基因表达 5、野生型P53基因表达 6、TNFa,（二）HF 特点：1、心肌细胞功能异常 2、心肌细胞数量减少（缺失） 指标：心肌凋亡指数( apoptotic index ） 凋亡细胞核数100个细胞核 （三）AD （阿尔茨海默病, Alzheimers disease） 特点：神经元进行性丧失 机制：神经元凋亡 致病因素神经元Ca2+内流-淀粉样蛋白合成相关基因神经元内-淀粉样蛋白含量神经元凋亡,（四）AIDS 特点：CD4+ T淋巴细胞显著 原因： CD4+ T淋巴细胞凋亡 机制：1、糖蛋白120（gp120）产生 2、合胞体的形成 3、Fas基因表达上调 4、分子模拟 5、细胞因子异常,6、生长因子缺乏 7、tat蛋白的产生 HIV感染可通过多因素、多途径诱导CD4+T淋巴细胞发生凋亡，从而导致CD4+T淋巴细胞大量减少。HIV也可诱导其他免疫细胞如B细胞、CD8+淋巴细胞、巨噬细胞发生凋亡 细胞凋亡不足与过度并存 （一）AS,特点： 1、血管内皮细胞凋亡过度 2、血管平滑肌细胞凋亡不足 机制： 1、氧化型LDL 2、ICE基因表达 3、Bcl-2基因表达 4、c-myc基因表达 5、TNFa （二）arrhythmia P细胞凋亡窦缓、病窦等 P细胞凋亡窦速、早搏等,第五节 细胞凋亡在疾病防治中的意义,合理利用凋亡相关因素 （一）利用凋亡诱导因素治疗一些因细胞凋亡不足引起的疾病 外源性TNF-a 诱导肿瘤细胞凋亡 高热或高温 4-6Gy低剂量照射人急性TC白血病细胞凋亡,（二）利用某些生长因子或激素来调控细胞凋亡,神经生长因子抑制神经元治疗AD 雄激素拮抗剂 抑制体内雄激素前列腺癌细胞凋亡 雄激素受体阻断剂 切除睾丸-降低体内雄激素 治疗前列腺癌 干预凋亡信号转导 阿霉素FasFasL信号系统肿瘤细胞凋亡 1-磷酸鞘氨醇（SPP）转递增殖信号治疗AIDS、AD 拮抗细胞凋亡,调节凋亡相关基因,研究发现，当野生型P53基因发生突变后其诱导肿瘤细胞凋亡的效应减弱，有利肿瘤细胞的增殖。P53基因是人类肿瘤最常发生突变的基因，例如：大约86的大肠癌和80小细胞肺癌患者，其P53基因发生突变。 目前，人们正在探讨用各种载体(如：腺病毒，逆转录病毒或脂质体)将野生型P53基因导人P53基因发生突变的肿瘤细胞内，重新恢复“分子警察”的职责，从而诱导肿瘤细胞凋亡。, 反义DNA （“基因封条”）是人工合成的与靶mRNA某区段互补的DNA片段，它与靶mRNA结合形成DNA-mRNA杂交链，抑制或封闭相应基因的表达。运用反义Bcl-2 DNA的研究表明，Bcl-2的“基因封条”确可显著提高肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性，使肿瘤细胞凋亡明显增多。,控制凋亡相关的酶,DNase抑制剂 钙阻滞剂抑制DNase治疗IRI 含锌药物抑制DNase治疗AIDS、AD Caspases抑制剂 非生物性：Caspase-1抑制剂、Caspase四肽抑制剂 生物性：主要指病毒蛋白成分（ CrmA、P35） 目前