长非编码RNA测序分析实战讲解之表达定量和差异及功能分析,卜中国科学院计算技术研究所,步骤四：表达值的定量 定量策略&工具 步骤五：差异分析 差异分析工具 步骤六：功能注释 附录：运行命令,3,转录组分析的通用套路,定量,鉴定,差异,功能,有多少RNA,RNA的表达量,结构、表达量、比例的变化,功能注释,测序数据,和参考基因组比对,测序评估及低质量过滤,编码基因表达注释,转录本重构,长非编码鉴定,长非编码表达注释,编码基因差异(特异)表达,GO功能显著性富集,Pathway显著性富集,功能富集网络图,长非编码差异表达,GO功能显著性富集,Pathway显著性富集,功能富集网络图,Fusions,Junctions,Genome Browser可视化,转录组第五讲,测序中国-测序学堂 转录组第三讲,转录组第四讲,转录组第六讲,步骤三：转录本的构建（Cufflinks/Scripture） 构建流程详解 基因存储文件: Gtf, Bed格式文件 Cuffmerge/cuffcompare合并转录本 转录本构建效果评估 多外显子比率、已知覆盖程度 步骤四：长非编码RNA的鉴定 鉴定流程详解 关键:如何判断编码或是非编码基因 工具：CNCI，CPC, PhyloCSF,上期回顾,6,一个测序实例,取样：晚期肝癌病人的肝组织(共4个) 癌旁组织(N) 原发灶(P) 转移灶(M) 门脉血栓转移灶(V),一组时间序列上的4个点的取样,步骤四：表达值的定量 定量策略&工具 步骤五：差异分析 差异分析工具 步骤六：功能注释 附录：运行命令,8,转录组分析的通用套路,定量,鉴定,差异,功能,有多少RNA,RNA的表达量,结构、表达量、比例的变化,功能注释,鉴定完成后的分析步骤,9,定量策略,FPKM expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced TPM transcript per million RPKM reads per kilobase per million mapped reads,10,定量,工具： Cufflinks(FPKM) Cuffdiff(FPKM)推荐 RSEM(TPM) 推荐 Range(RPKM),FPKM定量,计算工具：cufflinks 输出结果 transcripts.gtf isoforms.fpkm_tracking genes.fpkm_tracking,转录本定量？ 基因定量？,定量：cufflinks -G ref.gtf o outdir tophat_outdir_N /accept_hits.bam,长编码RNA表达定量,蓝线：长非编码基因,黑线：非编码基因,N,P,M,V,步骤四：表达值的定量 定量策略&工具 步骤五：差异分析 差异分析工具 步骤六：功能注释 附录：运行命令,14,差异分析,差异分析工具： Deseq Hypothesis testing H0:no difference between tow conditions. Negative Binomial for reads count Cuffdiff Test A.FPKM - B.FPKM with normal distribution SAMseq Nonparametric methods Mann-Whitney statistic Need many samples/replicates in conditions EBseq Empirical Bayesian mode(for TPM),Cuffdiff输出结果,isoforms_exp.diff genes_exp.diff splicing.diff the relative contribution of different isoforms is significantly different tissue 1 is 80/20 for two isoforms and tissue 2 is 50/50 tss.diff,表达差异分析结果,P/N M/N V/N = 342 coding genes,P/N M/N V/N = 312 lincRNA genes,17,动态变化分析(特异性分析),JS score ranging from 0 to 1;,Jensen-Shannon (JS) Score,A perfect tissue-specific pattern will be scored as JS = 1,18,动态变化分析(特异性),步骤四：表达值的定量 定量策略&工具 步骤五：差异分析 差异分析工具 步骤六：功能注释 附录：运行命令,20,功能注释,工具： David Go(For coding genes) http:/david.abcc.ncifcrf.gov/ ncFANs(for lincRNAs) https:/www.bioinfo.org/ncfansv2/,David GO: 数据上传,David GO: 注释数据库选择,GOTERM_BP_FAT,KEGG_PATHWAY,David GO: Functional Annotation Clustering,David GO: Functional Annotation Chart,25,功能注释,步骤四：表达值的定量 定量策略&工具 步骤五：差异分析 差异分析工具 步骤六：功能注释 附录：运行命令,运行命令汇总,差异分析&定量：,cuffdiff -o cuffdiff_outdir T -labels N,P,M,V refgene.gtf N.bam P.bam M.bam V.bam,Cuffdiff2: http:/www.nature.com/nbt/journal/v31/n1/full/nbt.2450.html,谢谢大家,