病毒学诊断,一、标本的采集与送检,基本原则与细菌的相似，但还要特别注意： 对本身带有杂菌或易受污染的标本，分离培养时应使用抗生素。 低温保存并尽快送检，因病毒在室温易失去活性。 血清学诊断标本应采集发病初期和病后23w内各一份血清，观察其抗体的动态变化。,二、病毒的分离与鉴定（金标准）,病毒的分离 1. 动物接种 2. 鸡胚培养：按病毒种类接种不同部位 绒毛尿囊膜 天花病毒、痘苗病毒、HSV等 尿囊腔 流感病毒、腮腺炎病毒等 羊膜腔 流感病毒的初次培养 卵黄囊 某些嗜神经病毒 3. 细胞培养：病毒分离鉴定中最常用的方法。 按其生长方式分为单层培养和悬浮细胞培养 按来源、染色体特征及传代次数等分为原代细胞、二倍 体细胞和传代细胞系,病毒在培养细胞中增殖的指标,1. 细胞的变化 细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）：有些病毒在细胞内增殖时可引起特有的细胞病变。 细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等； 邻近的细胞相互融合形成巨细胞(融合细胞)如：麻疹病毒、巨细胞病毒； 在培养细胞中形成胞质或核内包涵体，如狂犬病病毒、麻疹病毒 2. 红细胞吸附(hemadsorption,HAd) 具有血凝素的病毒（流感病毒等），使受染细胞膜含有病毒血凝素抗原成分，能与红细胞结合出现红细胞吸附现象，以检测是否有病毒在细胞内增殖。 3.干扰现象(interference) 某些病毒感染细胞时不出现CPE、Had等变化，但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖，从而阻抑后者所特有的CPE。 4. 细胞代谢的改变 培养液的PH改变, 病毒的数量与感染性测定 常用的方法：蚀斑测定法和50%组织细胞感染量（ID50或TCID50） 空斑形成单位（PFU）：可测定病毒数量，空斑（P1aque）是病毒在单层细胞中增殖并扩散而形成的不易着色的病灶区。一般是由一个感染性病毒体大量复制形成，类似细菌的菌落，称为空斑形成单位。病毒悬液中感染性病毒量以每毫升中的空斑形成单位数来表示。 50组织细胞感染量（TCID50） 是病毒毒力测定的方法，应用不同稀释度的病毒悬液接种动物、鸡胚或细胞培养，引起50发生病变或死亡的最小病毒量。可以估计病毒感染的强弱程度及含量。, 新分离病毒的鉴定,病毒核酸类型的测定 DNA病毒和RNA病毒 理化形状的测定 包括病毒颗粒大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 形态学观察 通过电镜和免疫电镜检查 血清学鉴定 病毒型别的最后鉴定须靠血清学方法 基因测序和生化对比,三、病毒感染的血清学诊断,中和试验(neutralizing test) 病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验，可用来检查患者血清中抗体的消长情况，也可用来鉴定未知病毒或研究病毒的抗原结构。适用于人群免疫情况的调查。 补体结合试验(comolement fixation test, CF test) 用已知病毒可溶性补体抗原来检测病人血清中相应的补体抗体。 血凝抑制试验(hemagglutinatia inhibition test, HI test) 相应的抗体与病毒结合后，阻抑了病毒表面的HA与红细胞的结合。常用于粘病毒及乙型脑炎病毒感染的辅助诊断及流行病学调查，也可鉴定病毒的型与亚型。 凝胶免疫扩散试验 主要用于诊断HBV与乙型脑炎病毒等感染。,四、病毒感染的快速诊断,形态学检查 1.电镜和免疫电镜检查 2.普通光学显微镜检查 病毒蛋白抗原检查 1.免疫荧光法 ( IF ) 2.固相放射免疫测定（SPRIA） 3.酶免疫测定（EIA） 特异性IgM抗体的检测 检测病毒核酸 1.核酸杂交技术 斑点杂交、DNA印迹技术 2.核酸扩增技术 聚合酶链反应(polymerase chain reation,PCR) 连接酶链反应(ligase chain reation,LCR) 反转录PCR (RT-PCR) 3.基因芯片技术(gene chip),特异性预防与治疗,特异性防治是应用获得性免疫的原理，给机体注射或服用病原微生物抗原（包括类毒素）或特异性抗体以达到预防和治疗的目的。这种方法称为人工免疫(artifical immunization)。 人工免疫分为人工主动免疫和人工被动免疫。 人工主动免疫(artifical active immunization)：将疫苗及类毒素（抗原）接种于人体，使机体主动产生获得性免疫力。主要用于预防。 人工被动免疫(artifical passive immunization)：输入含有特异性抗体的免疫血清、纯化免疫球蛋白抗体或细胞因子等免疫制剂，使机体立即获得特异性免疫力的过程,一、人工主动免疫,疫苗 1. 死疫苗(killed vaccine) 用物理或化学方法将其杀死病原微生物，但仍保持其抗原性的一种生物制剂。如霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗等。 2. 活疫苗(living vaccine) 通过毒力变异或人工选择发而获得的减毒或无毒株，或从自然界筛选得到的毒力弱毒或无毒株经培养后制成的疫苗亦称减毒疫苗(attenuated vaccine) 。如BCG、鼠疫、脊髓灰质炎等减毒活疫苗。 死疫苗和活疫苗各有优缺点，见下表。 3. 新型活疫苗,活疫苗与死疫苗的比较,区别点 活疫苗 死疫苗 制品特点 减毒或无毒的疫苗 死菌，仍保持免疫原性 制备方法 通过非正常培养减毒株 通过物理化学方法使病原体失活 接种次数 1次 23次 接种量 量小 量大 接种反应 可在体内增殖，类似于 在体内不增殖，可出现发热、全 轻型感染或隐性感染 身或局部肿痛等反应 免疫的类型 体液免疫和细胞免疫 体液免疫 免疫效果 较好，维持长(15年) 较差，维持短(0.51年) 毒力回升 有可能 不可能 安全性 对免疫缺陷者有危险 安全性好 疫苗稳定性 相对不稳定 相对稳定 保存 不宜保存，4存活2w， 宜保存，4存活1年 真空冻干可长期保存 生产和成本 生产较复杂，成本高 生产简单，成本低,4. 基因工程疫苗 利用基因工程方法获得带有病原体保护性抗原表位的目的基因，将其导入原核或真核表达系统，表达该种保护性抗原，提纯后研制成疫苗。 5. 重组载体疫苗 将编码某一蛋白抗原的基因转入减毒的病毒或细菌而制成的疫苗。 6. 合成疫苗 根据病原体抗原的氨基酸序列合成的多肽作为疫苗。 7. 亚单位疫苗 利用微生物的某种表面结构成分（抗原）制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，称为亚单位疫苗 。 8. DNA疫苗,9. 转基因植物疫苗 将编码某一病原体保护性抗原的基因转入植物并在植物中表达，当人们吃这些植物性食物的同时，完成一次预防接种。 10. 治疗疫苗 以治疗为目的的一种新兴疫苗。,病毒感染的治疗, 抗病毒化学试剂 1. 核苷类药物： 无环鸟苷(阿昔洛韦)、丙氧鸟苷(庚昔洛韦)、阿糖腺苷、叠氮胸苷、双脱氧肌苷、拉米呋定等。 作用机制： 抑制病毒基因复制 模拟核苷成分掺入病毒基因组 竞争病毒复制酶 抑制病毒基因转录 2. 非核苷类反转录酶抑制剂 nevirapine(第一个新合成的非核苷类反转录酶抑制剂，1996年获准用于治疗HIV )、 pyridone,3. 蛋白酶抑制剂 赛科纳瓦(saquinavir) 1995年批准的第一个蛋白酶 抑制剂 英迪纳瓦(indinavir) 1996年批准的新一代蛋白酶抑 制剂，用于HIV 4.其他抗病毒药物 金刚烷胺(amantadine)和 甲基金刚烷胺(rimantadine)： 主要用于治疗甲型流感。 甲酸磷霉素(phosphonoformic acid,PFA)： 可抑制多种疱疹病毒。, 干扰素和干扰素诱生剂的应用,干扰素 主要用于甲、乙、丙型肝炎，HSV，乳头瘤病毒和鼻病毒等感染的治疗。 IFN诱生剂 polyI:C、甘草甜素、芸芝多糖 中草药防治病毒感染 黄芪、板蓝根、大青叶等能抑制多种病毒 基因治疗(gene therapy) 目前还处于研究阶段。 主要有如下几种治疗方法 ：, 反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, asON) 根据病毒基因组已知序列，设计能与病毒基因的某段序列互补的寡核苷酸，称为反义寡核苷酸。其介入细胞后，通过对病毒基因的某序列特异性结合，抑制病毒的复制。 干扰RNA (short interfering RNA,siRNA) 用双股短小RNA，导致相同序列病毒基因的静止，同源mRNA降解。 核酶(ribozyme) 一种抑制病毒基因的基因治疗剂，既能与靶基因序列结合又具酶活性的一类RNA分子。,