细胞培养基本技术,内 容,细胞培养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策,细胞培养的概念,20世纪初才创立的一种研究动物细胞行为的方法。 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。,细胞培养的应用,1. 药物研究与开发 (1) 新药筛选 (2) 疫苗研究与开发 (3) 基因工程药物研究与开发 (4) 细胞工程药物研究与开发 2. 基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 3. 生物制药 (1) 疫苗生产 (2) 基因工程药物生产 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产 (4) 细胞工程药物生产,细胞培养的应用,细胞培养的优点,1.活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动 2.可控制：可选择特定的研究细胞种类、性质、阶段 可控制调节条件：物理、化学、生物等因素 可采用各种研究技术、记录方法： 倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等。 3. 样品均一性：来源于同一组织同一种细胞。 4.经济、规模和机械化,细胞培养的局限性,人工模拟体内环境的技术已经很高, 但人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中，必然发生变化。,概念：原代与传代,原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。,培养细胞的生长方式,贴壁生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体组织来源细胞、上皮细胞。 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。,贴壁细胞,贴壁细胞,贴壁细胞,贴壁细胞,悬浮细胞,细胞培养的环境,1、无污染环境：化学污染、微生物污染 2、温度环境：37。偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强， 3、气体环境： 95%空气加5%二氧化碳 4、酸度环境：大多数细胞的适宜PH 为7.2-7.4，细胞耐酸性比耐碱性大一些。 5、 细胞培养基：合成培养基、天然培养基。,细胞培养成功的关键,1. 实验材料的清洗、灭菌。 2. 无菌操作 3. 勤劳,内 容,细胞培养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策,实验设备与器材,CO2培养箱 超净工作台,倒置显微镜,滤 器,电动移液器 超纯水仪,液氮罐,培养瓶、培养皿,实验器材的清洗和灭菌,清洗的重要性 1. 除化学污染：盐、油污、蛋白质、重金属等 2. 使培养瓶内表面带负电荷，供细胞附着。 不要让污染了的器皿变干！ 灭菌的重要性 除去微生物污染,酸液配方,新的玻璃器皿的清洗灭菌,自来水刷洗，除去灰尘。 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。 刷洗、烘干：泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 泡酸、清洗：用酸液浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗10次，最后蒸馏水冲洗3-5次。 烘干、包装：移液管和滴管的尾端 要塞入棉花。 高压灭菌 烘干备用,使用后的玻璃器皿的清洗灭菌,刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿立即用清水刷洗干净 自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净，烘干。 泡酸、清洗：烘干后泡入酸液，12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗10次（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），过蒸馏水3次。 烘干、包装 高压灭菌 烘干备用,金属器皿,金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。,橡胶和塑料,刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干净 自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净烘干。 泡入5盐酸过夜。 自来水冲洗10次，过蒸馏水3次 烘干 高压蒸汽灭菌 烘干备用 滴管胶头可用75酒精浸泡5分钟，紫外线照射消毒。,水、溶液、培养基,水：超纯水。 至少为三蒸水或去离子水。,需配制的溶液,平衡盐溶液（PBS或D-Hanks等） 胰酶 培养基,溶液除菌方式,高压蒸汽灭菌：平衡盐溶液 过滤除菌：不能高压的溶液，如培养基、胰酶等,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子 ； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 血清的除菌：购买高质量的无菌血清。不要自己试图对血清除菌。,常用培养基配制要领,购买合成培养基干粉。 仔细阅读说明书，确定配制方法，是否需要添加其他成分，如NaHCO3、HEPES、谷氨酸盐等。 确保所有的成分完全溶解 确保水足够纯（包括调节pH值用液）。 过滤除菌后取10ml置于干净的培养瓶中，放入培养箱内培养三天，如培养基无改变，方可继续使用。,培养基配制方法 （Gibico DMEM为例）,拆开包装，将包装中粉末倒入一个1L烧杯中。 用水将包装内壁的粉末冲洗入烧杯中。 加入3.7g 碳酸氢钠。 加水至900ml。 调pH值至7.4 定容至一升 过滤除菌 过滤最后取10ml置于干净的培养瓶中，放入培养箱内培养三天，如培养基无改变，则可继续使用。 临用前加10牛血清。,培养基过滤除菌装置,培养基过滤装置使用方法,用自来水彻底清洗装置。 用蒸馏水漂洗两次。 烘干（塑料滤器烘干温度不可超过60度） 正确安装好滤膜和整个装置，包装。 高压灭菌。,其他试剂,胰蛋白酶液： 0.25胰蛋白酶0.02EDTA，用平衡盐溶液溶解，过滤除菌。 平衡盐：高压灭菌。,内 容,细胞培养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策,无 菌 技 术,微生物污染一直是细胞培养的主要问题。,无菌技术总原则,任何时候都要毫不动摇的在每一个操作环节都坚持高标准的无菌技术！ 预防为主！ 不要让无菌程度低的物品沾染无菌程度高的物品！,无菌程度梯度示意图,培养室的灭菌,定期打扫培养室室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3来苏尔或者新洁尔灭或者0.5过氧乙酸擦拭。 CO2培养箱灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射。保持培养箱内空气干净，定期消毒。定期更换蒸馏水。 实验前灭菌：打开紫外灯20-30分钟 实验后灭菌：用75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台，打开紫外线照射20-30min,实验人员的无菌准备：,肥皂洗手。 穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、穿好拖鞋 戴乳胶手套，75酒精擦手。,工作面无菌原则,保持工作面干净。 使用前用75乙醇充分擦洗工作面，打开紫外灯照射30分钟。 尽量少放物品：带入必须的，移走不必要的。 工作台面内物品整齐有序。 实验完毕后移走所有物品，并彻底擦洗工作面，开紫外灯照射30分钟。,正确的工作台面布局,物品在工作台中部洁净区围成新月状，酒精灯位于中央。,保持台面整齐,Good！,Bad！,无菌操作,凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面 靠近酒精灯火焰操作。 玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必须过火灭菌 打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近。 无菌级别高的物品不能触碰无菌级别低的物品。手不能从敞开的瓶口上方经过 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 手握试管、滴管、移液管时尽量远离工作端。 尽可能移走不需要的物品，在操作中经常用酒精擦拭台面。 尽可能减少开盖时间。 随时擦去任何溢出物。,无菌操作,任何时候都不要把液体从一个无菌容器倒入另一个无菌容器。 倾倒废液时防止溅起和瓶口回流。 在视野范围内工作。,无菌技术,每人准备一套实验材料（器皿、溶液等），不可混用。 无菌的思想贯穿到细胞培养的任何操作步骤。,内 容,细胞培养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策,原代培养,细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。,原代培养策略,原代培养分离小鼠胚胎,原代培养分离鸡胚,原代培养酶解组织,内 容,细胞培养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策,概念“代”,细胞分裂一次？ 错！ 培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。,传代培养的要诀（一）,该出手时就出手！ 该换液时就要换液，该传代时就要传代！ 否则，细胞就不是那个细胞 细胞会衰退、分化、生长缓慢，多数情况下很难扭转和补救。,传代培养的要诀（二）,勤观察 每天肉眼观察培养基颜色是否异常，有无混浊 观察培养基颜色变化速度是否异常：变化过慢意味着细胞生长过于缓慢；变化过快而细胞密度并不大，表明有污染的可能性。 镜下观察细胞形态、生长速度。 观察培养箱水盘中的水是否干净。 观察CO2压力表。 观察液氮罐内液氮体积,传代培养的要诀（三）,严格无菌操作 轻柔：避免机械力损伤细胞，重悬细胞时尽量用50ml离心管，通过晃动离心管分散细胞，尽量避免过力吹打。离心力不可超过300g（普通台式离心机水平转子1000rpm）。 快速：防止因过分小心导致操作时间过长，增加污染概率。,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 平台期,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时 贴壁期：血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度抑制。尽量避免细胞