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酵母操作手册(一)酵母的冻存、复苏以及培养注:本手册改编自商业化酵母操作方案,依据本实验条件修改,并不适合所有实验室!培养基配方: 10X Dropout 粉剂(1L) AA Name所购数量 ( g )10X 浓度 (mg/L)实称 (g)L-Isoleucine53000.3L-Valine2515001.5L-Arginine HCl502000.2L-Lysine HCl503000.3L-methionine102000.2L-Phenylalanine105000.5L-Threonine1020002L-Tyrosine253000.3L-Uracil252000.2共计5.5将各AAs称量后,在研钵中磨合混匀,置于干净器皿中。单独用AA筛选溶液 AA名称 体积 ( ml )浓度(mg/ml)实称 (g)L-Adenine hemisulfate salt10020.2100 XL-Histidine HCl monohydrate10020.2100 XL-Leucine100101100 XL-Tryptophan10020.2100 X过滤除菌YPDA(1L)浓度实称 (g)Difco peptone20 g/L20Yeast extract10 g/L10Agar (for plates only)20 g/L20Glucose2%20Adenine hemisulfate0.003%15 ml 0.2%AdeSD Media (1L)浓度实称 (g/ml)加H2O至1000ml, 114,20min。YNB6.7 gAgar(for plates only)20 gGlucose2%2010X基本DO 粉剂0.55 g100X单独用AA10 ml1 长期冻存: 无营养缺陷型的酵母株存在含25甘油的YPDA中,然后冻存于-70冰箱中,若要保存大于一年,务必使温度不要低于-55。 转染质粒的营养缺陷型酵母株存在含25甘油的相应的缺陷型培养基(SD)中,以避免质粒丢失。制备方法:用无菌牙签从琼脂板上将一个单克隆挑出,置于含200500lYPDA或SD的1.5ml离心管中,注意尽量使牙签上的菌落都涮在溶液中,然后盖好盖,在旋涡器上剧烈振荡混匀,再加入无菌甘油,使其终浓度为25,再次振荡混匀,存于-70冰箱中。2 复苏:准备一无菌1.5ml离心管,加入100-200l YPDA或SD,用无菌牙签挑取些许冻存菌置于离心管中,稍微涮洗一下牙签(让挑取的冰屑融化),混匀后吸取100l涂平板,30培养23天。刚长出克隆的平板用封口膜密封后,在4可保存12个月。注意:有时冻存的酵母可能沉到离心管底部,所以在复苏时,将其全部融化,然后振荡混匀,再复苏。3酵母的液体培养:用无菌牙签挑取一个两个月以内的酵母克隆,每5ml液体培养基所需的克隆大小为23mm,所以,如果单个克隆不够,可以多挑几个。剧烈振荡,使酵母细胞分散到液体中,30,200rpm振荡培养1618hr,但通常好像需要24hr,甚至更长才能达到稳定期(OD600 1.5),所以一般在上午开始摇,第二天下午收。如果需要中期培养物,则将上面的稳定期培养物稀释到OD600 = 0.2-0.3之间,然后30,200rpm振荡培养35hr,此时的培养物OD600 = 0.4-0.6之间。可见酵母的细胞周期约为35hr。(二)质粒转化酵母细胞手册试剂配方:单链Carrier DNA (SS-DNA)(2 mg/ml)注意:你不需要将Carrier DNA超声切割,因为实验证明Carrier DNA越大效果越好!只要如下操作即可。1 称取200mg高分子量DNA(III型脱氧核糖核酸钠盐,鲑鱼精DNA,Sigma D1626),溶于100ml TE(10mM Tris.HCl, PH 8.0, 1.0mM EDTA)。先用10ml枪头吹吸使DNA湿化,然后用磁性转子于4缓慢搅拌过夜使其完全溶解;如果紧急,也可于室温剧烈搅拌2 3hr使其完全溶解。2 将其直接分装成1ml/管,储存在-20。3 使用之前,先取出一管沸水浴至少5分钟,然后迅速放置于冰上骤冷。要点: I:Carrier DNA沸水浴后可以用3至4次而不需要再次沸水浴。如果转化效率开始降低,请再将其沸水浴或重新换一管。II:本手册中使用这种低浓度的Carrier DNA(2mg/ml)便于操作,并且重复性高。III:我们原来曾用酚:仿抽提来纯化这些Carrier DNA,以保证达到最好的转化效率。如果你购买的鲑鱼精DNA已是非常纯的,可以不用抽提。所以购买后先检测一下你的DNA的纯度。Carrier DNA无菌性要求:我们用灭过菌的TE缓冲液溶解DNA,所以在经过5分钟的沸水浴后,可以基本上认为它是无菌的。实验也证明了这一点。 1.0 M Lithium Acetate储液lithium acetate用去离子水溶解成1.0M,然后过滤除菌。没必要调节该溶液的pH值,该溶液配好后pH在8.4至8.9之间。 注意: Lithium Acetate也可以通过高压20分钟来达到灭菌效果,但最好还是过滤除菌。PEG 3350 (50% w/v)PEG 3350购自Sigma公司,产品号为 P3640。将其用双蒸水或去离子水按 W/V = 50%溶解,然后过滤除菌。为了得到您满意的转化效率,务必注意PEG的浓度是否准确。另外,请将PEG溶液储存在密封性很好的器皿中,以防水分蒸发而导致PEG浓度上升。在正常手册中,PEG在转化体系中浓度为33(W/V),其浓度微弱的变化都可能导致转化效率达降低。 1取一150ml烧杯,加入50g PEG3350,然后加入35ml ddH2O。2磁子搅拌直至其溶解,这大约得花30分钟。3将溶液转至100ml容量瓶或量筒中,注意用少量水清洗烧杯数次,将清洗液加入到容量瓶中,然后定容至100ml混匀。4用0.45m滤器过滤除菌,储存在灭过菌的器皿中。质粒DNA:质粒DNA可以用常规方法制备,转化酵母时没必要对其进行进一步的纯化。因为RNA在LiAc/SS-DNA/PEG转化过程中,RNA本身就是一个很好的载体(Carrier),所以不需要在制备DNA时除去RNA。我们在实验中常用碱裂解法大提质粒,但LiCl处理可以免去,TE中也不加RNase。常规转化酵母细胞手册 1将酵母接种在2 5 ml YPDA或10 ml 极限培养基中,于30、200rpm培养18至20h。2取少许在显微镜下计数,使酵母浓度在108/ml左右。计数时注意: 1取少许酵母用水稀释10倍或100倍(假设为10倍)2小心地取10l置于计数板和盖玻片之间,使其虹吸进入两者中间的带格空隙中,静置几分钟。格子区域为1平方毫米,它被分为25个正方形,计数板和盖玻片之间的体积相当于104ml。3计5个正方形方格中酵母的数量(假设为239个)4按如下方法计数:5个方格中的酵母数 X 稀释倍数 X 1/25个正方形方格所占的体积。所以按3中所计之数,应该为239 X 5 X10 X 1/104 = 1.2 x 108个酵母/ml。5芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)通过芽殖来进行繁殖,计数时出芽的酵母只能算是一个细胞,如果出的芽与原来的细胞等大,可以算作两个。有些酵母系会形成团块,导致铺平板时克隆数减少,因为一团细胞只能长成一个克隆,这使得下一步的分析变得困难。6我们也可以用OD600来确定酵母的浓度,但不同的酵母株中,这种细胞数与OD600之间的关系也不同。3取已在30预热的YPDA(50ml),加入2中的酵母细胞,使酵母浓度在5 x 106/ml。430,200rpm振荡培养,使酵母细胞浓度到2 x 107/ml。这大约得花3至5小时。这些培养物足可以做10个转化。注意:I:务必使细胞至少分裂两次II:转化效率(转化子/g质粒/108酵母细胞)在第3至第4个分裂期之间保持稳定。5用50ml离心管于4,3000g(约5000rpm)离心5分钟。6倒去上清,用25ml无菌水重悬,再次离心。7倒去水,用1ml 100mM LiAc重悬,转移到1.5ml离心管中。8在微量离心机上,以最高速度(14,000rpm)离心15秒,用枪头小心将上清LiAc去除。9加入大约400l 100mM LiAc重悬细胞,使酵母细胞终浓度在2 x 109 /ml。注意:如果在步骤4中,酵母细胞浓度大于107 /ml,那就多加入一些LiAc,使步骤9中细胞终浓度保持在2 x 109 /ml。10取出一管Carrier DNA,沸水浴5分钟,迅速置于冰上骤冷。*没必要每次都将Carrier DNA沸水浴,沸水浴后的DNA可以冻化3至4次,但记住每次拿出来的时候都要将其置于冰上*11将步骤9中重悬的细胞剧烈振荡,然后取出新的离心管,在每管中加入50 l(注意离心管上做好标记,以防混淆)。微量离心机上最高转速离心15秒,然后用200 l枪头将LiAc吸出。12按以下“转化混合物体系”,依次加入相应试剂:240 l PEG (50 W/V)36 l 1M LiAc50 l Carrier DNA (2.0 mg/ml)X l 质粒DNA (0.1 10 g)34 X l 无菌水总体积为360 l注意:此处的加入顺序非常重要,PEG必须得首先加入,它可以将酵母细胞与高浓度的LiAc分开,使酵母免受高浓度之害。另外,也可将以上试剂(除了质粒DNA之外)预先混匀,然后在每管酵母沉淀上加入355l这种预混物(TRAFO),最后加入5l质粒DNA混匀。注意,TRAFO非常粘稠,所以一定要小心加入正确的体积数。13剧烈振荡,使酵母细胞与溶液完全混匀,这通常需要花1分钟。14置于30,于200rpm振荡培养30分钟。1542水浴中,热激30分钟。注意:不同的酵母细胞株,热激时间也可能存在不同。如果你需要高转化率,请先检测一下热激时间。16在微量离心机上,6-8000rpm离心15秒,用200l枪头小心去除上清。17小心、柔和地加入1ml无菌水,柔和地将沉淀细胞悬浮。注意:如果需要高转化效率,请尽可能地柔和。另外,清洗次数不宜再多,因为容易损失转化细胞。18取2至200l铺于极限培养基平板上,如果所取体积少于200l,另外再加一些无菌水使终体积至200l。注意:涂平板时,也尽可能柔和,用最少的划数使溶液平铺在整个平板上。19等溶液被完全吸收后,置于30培养2至4天。注意:转染两个质粒时,如含诱饵蛋白的质粒和文库质粒,可以同时将它们转入酵母中,但这样的转化效率会降低,因为只有大约3040的转化细胞可以同时含有两种质粒。所以,这种情况下,最好先将诱饵质粒转入酵母中(用本方法或快速转染的方法),然后再制备含该质粒的酵母感受态,来
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