离子液体中酶催化拆分布洛芬的反应研究目 录摘要11 前言21.1脂肪酶简介21.2离子液体概述31.3酯化反应41.4本论文选题目的和意义及主要内容52 实验部分52.1实验材料52.2酶催化拆分反应52.3产物分析52.4对映选择性的计算63 结果与讨论63.1酶的筛选63.2异辛烷和BMIMPF6溶液比例的影响83.3反应时间的影响93.4酶的负载效应104 结论11参考文献12谢辞13离子液体中酶催化拆分布洛芬的反应研究摘 要：在分别含有BMIMPF6和BMIMBF4两种离子液体的体系中，将两种天然酶和四种商品酶用于拆分布洛芬的反应。与纯异辛烷相比，在含有离子液体的异辛烷体系中脂肪酶表现出较高的转化率。虽然，柱状假丝酵母菌商品酶的对映体选择性（E=8.5）相比其他酶高，但还有另一种天然脂肪酶，同样具有良好的对映体选择性（E=4.6）。通过反应条件的优化（异辛烷/离子液体的比例，酶量和反应时间），AN脂肪酶(15%w/v)在BMIMPF6：异辛烷=1:1体系中反应96小时后可以获得更高的对映体选择性（E=9.2）。关键词：脂肪酶；布洛芬；离子液体Esterification of (R, S)-Ibuprofen by native and commercial lipases in a two-phase system containing ionic liquidsAbstract: Four commercially available lipases and two native lipases from Aspergillus niger AC-54 and Aspergillus terreus AC-430 were used for the resolution of (R, S)-Ibuprofen in systems containing the ionic liquids BMIMPF6 and BMIMBF4. The lipases showed higher conversion in a two-phase system using BMIMPF6 and isooctane compared to that in pure isooctane. Although the best enzyme was a commercially available lipase from Candida rugosa (E =8.5), another native lipase, produced in our laboratory, from A niger gave better enantioselectivity (E= 4.6) than the other lipases tested (E=1.9-3.3). After thorough optimization of several reaction conditions (type and ratios of isooctane/ionic liquid, amount of enzyme, and reaction time), the E-value of A. niger lipase (15% w/v) could be duplicated (E= 9.2) in a solvent system composed of BMIM PF6 and isooctane (1:1) after 96 h of reaction.Keywords: lipases, Ibuprofen，ionic liquid1.前言1.1 脂肪酶简介脂肪酶( Lipase EC3，甘油酯水解酶)是一类水解油酯的酶类。脂肪酶的水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键。不同于其它水解酶,脂肪酶催化作用系统是一种非均相体系。水溶性的酶催化作用发生在水不溶性底物和水的界面上。这种界面上的催化作用机制仍不甚清楚，不能简单用Michaelis-Menten学说解释酶与底物间的反应机制。有人提出了脂肪酶在油水界面上定位的假设,提出了超底物的模型,该模型能解释脂肪酶的一些行为，但还需要进一步的实验证明和修正。此外，脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游离脂肪酸合成甘油脂活性1。由于脂肪酶独特的催化特性，活力测定具有以下特点：（1）方法的多样性；（2）测量过程影响因素的复杂性；（3）酶活力定义的混乱性。本文对脂肪酶活力测定方法及影响因素进行综述。测定脂肪酶的方法可分三类：（1）通过测定底物的减少来度量酶活的大小；（2）测定产物增加判断酶活的大小；（3）其他方法。由于微生物脂肪酶种类多，作用温度及pH:范围比动植物脂肪酶广、底物专一性高，并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂，因此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源，关于脂肪酶在工业应用的研究也越来越多2。脂肪酶是一种“丝氨酸水解酶”构成脂肪酶活性中心的三元组之间，丝氨酸残基通过氢键和组氨酸相连。反应过程中，三者通过与底物形成四面体中间体复合物完成催化过程。通常情况下，脂肪酶的活性部位被一个螺旋片段（又称“盖子”）所包住。在底物（如醇酸或酯）存在的情况下，酶的结构发生变化，“盖子”打开，含有活性部位的疏水部位就暴漏出来。“盖子”螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油/水界面的结合面能力，其双亲性的减弱将导致脂肪酶活性的降低。“盖子”的外表面积相对亲水，而其面向催化部位的内表面则相对疏水。由于脂肪酶与油/水界面的缔合作用，使“盖子”张开，活性部位得以暴漏，这使得脂肪酶与底物的结合能力增强，此时第五就容易进入疏水性的通道而与活性部位结合，形成酶-底物复合物。液体测定体系：甘油三酯和水制成的乳胶，因胶束对入射光的吸收或散射具有乳浊性状，当胶束中的甘油三酯在脂肪酶催化转变为甘油和脂肪酸，导致胶束分裂，悬液散射光或浊度下降。通过检测甘油三酯乳化液在340nm或365nm的吸光度随时间的降低，来测定酶活力的大小。例如英国RANDOX公司提供的试剂盒，其主要成分是：缓冲液(26mmol/ L，pH9.2) 、去氧胆酸钠(35 mmol/ L)、氯化钙(4 mmol/ L)，三油酸甘油酯(0. 3 mmol/ L)，co-lipase(3mmol/ L)，同时还备有脂肪酶标准液。该方法的缺陷是早期反应阶段的非线性及其线性范围有关，同时为了获得准确可靠的数值，用纯的脂肪酶溶液作标准曲线是必要的。目前该方法已成功用于血清脂肪酶的测定3-4。1.2.离子液体概述离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的在室温或接近室温下呈液态的盐类5。它完全由离子构成，没有明显的蒸气压，对热稳定并具有高的极性。离子液体作为一种新兴的绿色试剂为酶催化反应开辟了广阔的前景。与有机溶剂不同，离子液体集高极性和低亲水性为一体，这使得它能够保持酶的催化活性构象并赋予其一定的构象可变性。离子液体的广谱底物溶解范围也使其能够同时溶解极性和非极性化合物。离子液体在有机合成中的应用研究近几年发展快，多数离子液体表现出中等极性有机溶剂的性质，极性相当醇和两极非质子溶剂，能促进反应速度,因此离子液体被作为反应介质、促进剂和催化剂应用于不同的合成方法中6-7。离子液体具有较强的极性，可溶解高极性底物，其良好的热稳定性、可以忽略的蒸汽压和物性可调控等优良的性质，使其有望成为非水相酶催化的新介质，酶在不同有机溶剂中有不同性能。同样，酶在离子液体中的活性、稳定性和选择性也变化多端。目前在大多数研究中都是将离子液体直接作为酶催化反应的溶剂，实验结果较为随机，无规可循，给探讨离子液体在酶催化反应中的作用带来了一定的困难。另一方面，由于离子液体的强极性，少量离子液体即可改变反应溶剂系统的性能，因此离子液体更有望成为酶催化反应溶剂工程的调控工具，所以有必要研究少量离子液体的存在对非水相酶催化酯化反应的影响。离子液体BMIM PF4和BMIMPF6中几种脂肪酶催化2-羟甲基-1,4-苯并二恶烷和乙酸乙烯酯的酯交换反应显示：PCL在BMIMPF6中的反应速率较在BMIMPF4和二氯甲烷中高，可能是两种离子液体亲水性不同的缘故。在无水BMIMPF4中反应速率逐渐降低，可能因为脂肪酶表面水分的丢失所致。在石油炼制工业中，几乎所有重要的工艺转化技术，如催化裂化、异构化、烷基化和重整都与酸催化反应密切相关。在揭示和描述酸催化烃类转化反应的历程和机理时，正碳离子反应机理是大家所公认的最有效的工具8-11。1.3 酯化反应(动力学拆分反应)酯是一大类重要的精细化工产品,应用范围涵盖了生产生活的方方面面，如用于合成香料、化妆品、食品及饲料添加剂、表面活性剂、防腐防霉剂、橡胶及塑料的增塑剂、制药工业的原料和中间体等12。在有机溶剂体系中，用酶催化醇的对映选择性酰化，是合成具有光学活性化合物及拆分外消旋醇的常用方法。在工业上，脂肪酶催化酯基转移反应被广泛应用于药物、农药、香料、保健品及中间体的合成。然而，底物的溶解性、酶在常见有机溶剂体系的活性问题常常导致收率和光学纯度的降低。KIM等在离子液体中考察了几种不同的仲醇与乙酸乙烯酯在脂肪酶催化下的酯基转移反应，发现产物ee(光学纯度)值高达99. 5 %，脂肪酶可以附着在离子液体中，产物经过分离后，脂肪酶/离子液体可以循环使用，尽管速率减慢，但是产物光学纯度并不降低。与传统的有机溶剂(THF，甲苯) 相比，在BMIMPF6或BMIMPF4中，产物的对映选择性得到了显著提高(可达25倍以上)。SCHOFER等在10种纯离子液体中，通过与乙酸乙烯酯的酯基转移反应对苯乙醇进行了动力学拆分。结果表明，某些以离子液体为介质的反应，与在有机溶剂甲基叔丁基醚(MTBE)中相比，酶的活性和产物的立体选择性都有明显提高。反应结束后，可通过蒸馏的方法得到分离的产物，同时在离子液体中，酶表现出良好的热稳定性，悬浮于离子液体中的酶可循环使用3次，尽管活性以10 %递减，但是选择性并不受影响。陈治明等13研究了以氯铝超酸型离子液体催化合成乙酸乙酯的酯化反应。结果表明，该类型离子液体具有良好的催化活性，乙酸转化率在10min内能达到95%，生成的酯与离子液体分层两相，催化剂可重复使用。马卫华等14合成了BuPyCl-AlCl3、EMIMBF4等离子液体，并应用于催化合成反丁烯二酸二乙酯。1.4本论文选题目的和意义及主要内容离子液体对于有有机化合物的拆分反应有及其关键的作用，它能够提高对映体的转化率和选择性，同时离子液体对于不同的脂肪酶会表现出不同的性质，每种离子液体都有其对应的高效酶，而且由于离子液体的不同性质对于酶的拆分反应有不通的结果。本实验对比观察，找出最有效的酶和离子液体系，从而提高布洛芬拆分反应。2 实验部分2.1 实验材料南极假丝酵母菌脂肪酶(CA)、洋葱假单胞菌酶(TL)和米黑根毛菌(RM)购自诺维信有限公司；柱状假丝酵母菌脂肪酶(CR)以及果胶酶(AN)购自西格玛化工(在pH=7.0和40条件下水解橄榄油，酶的活性0.56mol/min/mg）。离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，离子液体BMIMBF4，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐BMIMPF6，异辛烷，异丙醇和(R, S)-布洛芬购自西格玛-奥德里奇化工药品公司。2.2 酶催化拆分反应4mmol(R, S)-布洛芬和12mmol的丙醇放置在锥形瓶中，再加入250l的异辛烷溶解。分别加入5%（w/v）脂肪酶，10%（w/v）的活性分子筛（4），25